通过 FASP 消化和数据独立分析，EPS-尿液的蛋白质配置文件

这项研究得到了卡坦扎罗麦格纳格雷西亚大学机构伦理委员会的批准，RP 41/2018。从所有登记在研究中的患者那里获得书面知情同意。 1. 样品准备 离心机 EPS 尿样在收集后的 2 小时内在 2，100 x g 下收集，在室温下 （RT） 10 分钟。将超自然人储存在-80°C，直到使用。 2. 样品解冻 将样品从消化前一天的-80°C转移到-20°C。 在样品处理之前，在 4 °C 下将样品转移 15-20 分钟，然后在 RT 传输。 3. 试剂准备法斯普 同日，准备以下解决方案：尿素缓冲器、尿素缓冲液中的 50 m 碘乙酰胺 （IAA）、50m 双碳酸氢铵和 500 m 二硫酸酯 （DTT）。 准备尿素缓冲器（尿素 8 M， 100 mM 特里斯-HCl pH 8）： 10 mL， 重 4，800 毫克尿素，并在添加 1 mL 1 M 特里斯 pH 8 后将其溶解在适当量的 HPLC 水中。每个样品需要800微升的尿素。 准备 500 mM 二甲基二醇 （DTT）：在 500 μL 的 HPLC 水中溶解 38.5 毫克 DTT。对于每个样本，需要 66.7μL 的 DTT。 在尿素缓冲区中准备 50 mM IAA：在 1 mL 尿素缓冲区中溶解 9.25 毫克 IAA。对于每个样本，需要 50 μL 的 IAA。 准备50m三聚苯甲酸氢钠（TEAB）。将 150 μL 的 1 M TEAB 添加到 2.85 mL 的 HPLC 水中。对于每个样本，需要 460 μL 的 TEAB。 在 HPLC 水中准备一种尝试素 （100 ng/μL） 的解决方案。此解决方案可存储在 -80 °C，并在使用前立即解冻。对于每个样本，需要 2 μL （200 ng）。 4. FASP 的蛋白质消化 稀释每个 EPS 尿液样本的 500 μL，其中 66.7 μL 为 10% （w/v） 硫酸钠 （SDS），66.7 μL 的 500 mM DTT 和 33.3 μL 的 1 M Tris pH 8，以溶解蛋白质并减少脱硫债券。在 95 °C 下孵化 10 分钟，轻轻摇晃。 在滤光单元（10 kDa）和离心机中加入300微升稀释的EPS-尿液样本，在14，000 x 克 处加入20分钟。 在滤清器中加入 200 μL 尿素缓冲器，在 14，000 x g 下将离心机加到 15 分钟内。重复此步骤，然后丢弃流过。 在 6，000 x g 下加入 50μL 的 IAA 溶液和离心机，25 分钟。 在 14，000 x g 下加入 200 μL 尿素缓冲器和离心机 20 分钟。重复此步骤，然后丢弃流过。 在 14，000 x g 下加入 200 μL 的 50 mM 碳酸氢铵缓冲区 （TEAB） 和离心机，20 分钟。重复此步骤。 将滤芯单元传输到新的收集管中。 加入 60 μL 的 50 m TEAB 缓冲器和 200 ng 的 trypsin，并在 37 °C 的热混合器中在一夜之间孵化样品。注意：为了避免样品在夜间孵化过程中蒸发，用一层铝箔包裹每个滤光片单元，然后用一层半膜包裹。 试穿素孵化后，加入140μL的水，以14，000 x g的离心机25分钟收集消化量（180-200微L）。 5. 为 SCX 纯化准备试剂 准备 1 mL 洗涤 1 （0.5% 用于微酸 （FA） 和 20% 丙酮三酯 （ACN））， 如下所示： 添加 50 μL 的 10% FA 和 200 μL 的 100% ACN 至 750 μL 的 HLPC 水。对于每个样品，需要 100 μL 的洗涤 1。 准备 1.5 mL 的洗涤 2 （0.5% FA 和 80% 的 ACN） 如下： 添加 75 μL 的 10% FA 和 1.2 mL 的 100% ACN 到 225 μL 的 HPLC 水。对于每个样品190μL的洗涤2是必要的。 准备 100 μL 的洗脱溶液（500 mM 醋酸铵 （AA） 和 20% 的 ACN）：加入 25 μL 的 2M AA 和 20 μL 的 100% ACN 到 55 μL 的 HPLC 水。 准备阶段提普如下。 使用钝端注射器针（仪表 16）用一层 SCX 树脂包装 200 μL 移液器尖端。将舞台提普插入以前被刺穿的微中柱盖中，以适应微孔。 将盖子组装到 2 mL 微中心上，从该中心移除原始盖子。刚刚组装的微型 SPE 离心设备应安装在台式离心机中。由于穿孔盖准备乏味，因此可以多次使用。 6. SCX 纯化 使用洗涤 2 将每个样品的 30 μL 稀释到 120 μL。 在提取树脂和离心机顶部添加 50μL 的洗涤 1，在 400 x g 上加 2 分钟，从而对阶段Tip进行条件调理。由于流量阻力取决于提取树脂包装到移液器尖端的力度，离心机速度可能需要调整，以获得 20-30 μL/min 的流速。在样品装载和清洗过程中，尽量不要让尖端干燥。 用 50μL 的洗涤 2 和离心机在 400 x g 下平衡舞台Tip 2 分钟。 使用较低的自旋速度加载稀释样品 （120 μL）。 用 50μL 的洗涤 2 和离心机在 400 x g 下清洗舞台Tip 2 分钟。重复使用50μL的洗涤1。注意：在此清洗后，树脂必须完全干燥。 使用较低的自旋速度缓慢地使用 7μL 的高脱溶液（500 mM 醋酸铵 （AA） 和 20% 的 ACN）的 Elute 肽混合物。 加入 27 μL 的 0.1% FA 以稀释 AA 并获取 LC-MS/MS 初步注射样本。最终稀释到 34 μL 将导致尿液和肽溶液之间的 1：1 体积比（1 μL 的纯化消化将对应于原始尿样 1 μL）。 7. 使用DDA分析按外部标准进行蛋白质定量 （图2） 通过在LC-MS/MS中注入2μL的肽消化液，并以以下校准曲线对由此产生的总肽面积进行插值，确定样品中的蛋白质含量： 使用 HeLa 消化库存（1 ng/μL、2.5 ng/μL、7.5 ng/μL、25 ng/μL、75 ng/μL）编写五种不同的 HeLa 消化解决方案（1ng/μL）。 将每个 Hela 溶液注入重复 （2 μL）中。 设置 LC-MS/MS 方法。 在15厘米、75微米（i.d）柱上注入5种 HeLa 肽混合物中的 2μL，并通过 75 分钟的线性梯度分别注入肽，流速为 230 nL/分钟，其中 75 μm i.d 列中含有 3μm C18 二氧化硅颗粒。使用由移动阶段 A（0.1% FA、2% ACN）和移动 B（0.1% FA 和 80% ACN）构成的二元梯度。 通过在 60 分钟内将移动 B 阶段内容从 6% 增加到 42%，并在额外的 8 分钟内从 42% 增加到 100%， 实现梯度提升。保持 5 分钟 100% B，然后在两分钟内返回到 0% B。 使用前 12 种方法在 DDA 模式下操作，并将 MS 全扫描范围设置为 350-1800 m/z、分辨率 70，000、ACG 目标 1e6 和最大注射时间 50 ms。将前体离子隔离的质量窗口设置为 1.6 m/z、分辨率 35，000、ACG 目标 1e5、最大喷射时间 120 ms、HCD 碎片在 25 NCE（标准化碰撞能量）和动态排除 15 秒。 使用Sequest作为搜索引擎分析原始文件，将人类单体完整蛋白质序列作为数据库。在此处介绍的实验中，该数据库于 2016 年 3 月下载，包含 42.013 个序列。 使用以下设置： MS 容差 15 ppm ， MS / MS 容差 0 . 02 Da ，通过设置两个错过的位点，尝试普辛作为酶。将莱辛、塞林、三氯苯、酪氨酸（+57.021）的碳水化合物甲基化和蛋氨酸的氧化作为动态修饰，将半胱氨酸的碳水化合物甲基化（+57.021）作为静态修饰。使用假发现率 （FDR） 的截止点将肽和蛋白质识别到 0.01，并通过渗透器过滤掉。 计算所有 MS1 肽信号的峰值区域。计算肽的总面积。 使用用于 HeLa 样品的相同 LC-MS/MS 方法，注入从 EPS-尿液样本中获得的 2μL 肽混合物，并使用用于 HeLa 数据处理的相同参数分析原始文件。 通过总结所有已识别肽的区域值并插值外部标准曲线来计算肽信号的总强度。这将提供EPS-尿液蛋白消化中肽含量的可接受估计。 8. C18 阶段提程序的试剂准备 准备 500 μL 溶液 A （0.1% 三氟乙酸 （TFA）， 50% ACN）： 加入 250 μL 的 100% ACN 和 10 μL 的 5% TFA 到 240 μL 的 HPLC 水。 准备 2 mL 的解决方案 B（0.1% TFA）：将 40 μL 的 5% TFA 添加到 1960 μL 的 HPLC 水中。 准备 100 μL 的洗脱溶液（0.1% FA，50% ACN）：加入 1 μL 的 10% FA 和 50 μL 的 100% ACN 到 49 μL 的 HPLC 水。 如前所述准备阶段提普斯。在这种情况下，使用 C18 提取盘。 9. SCX/C18 阶段提程序 注意：通过 C18 阶段提示协议净化 EPS 尿消化以去除盐分。 从2微克肽开始（初步注射量化）。在洗涤 2 SCX 中稀释消化溶液 4 倍，然后按照上述情况进行（在”SCX 净化”部分）。使用较低的自旋速度（5μL/分钟流速），缓慢地使用 7μL 的高脱溶液（500 mM 醋酸铵 （AA） 和 20% 的 ACN）将肽混合物洗脱。 用 150 μL 的三氟乙酸 （TFA） 酸化 SCX 提升，以实现低于 3 的 pH 和低于 5% 的有机溶剂浓度。 将 C18 阶段Tip 与 50μL 的溶液 A 和离心机在 400 x g 下调节 2 分钟。平衡 C18 阶段Tip，50μL 的溶液 B 和离心机在 400 x g 下 2 分钟。 使用较低的旋转速度缓慢地将样品加载到舞台尖端。 用 50μL 的溶液 B 和离心机清洗 C18 阶段芯片。 使用较低的自旋速度，用 10μL 的洗脱溶液慢慢稀释肽混合物。 在真空离心机中以30°C将高清（10°C）干燥3分钟。添加 47 μL 的 0.1% FA.预期肽浓度为 40 ng/ μL。 10. DIA 分析 （图 3） nanoLC 分离：使用 140 分钟的线性梯度分离肽混合物，流速为 230 nL/min，在 15 厘米、75μm ID 柱上，该柱内装有 3 μm C18 二氧化硅颗粒。 以 230 nL/分钟的流速执行梯度弹性，并在 90 分钟内将移动 B 阶段内容从 3% 增加到 25%，然后在 30 分钟内从 25% 增加到 40%，最后在 8 分钟内从 40% 增加到 100%。 100% B 的 10 分钟后，将列与移动阶段 A 等于 15 分钟。 质谱参数：使用采用以下扫描周期的方法执行 DIA 分析：（i） 分辨率为 17，500 的完整扫描 MS 事件（AGC 目标 1e6， 最大注射时间 50 ms）， 其次是 （ii） 20 个窗口，隔离宽度为 20 米/z， 起点为 m/z 350，（ii） 5 个窗口为 50 m/z 隔离宽度，（iv） 1 窗口为 200 m/z 隔离宽度，结束 DIA 扫描范围为 1200 m/z。以分辨率 35，000（AGC 目标 5e5、最大注射时间 120 ms 和 25 NCE）执行 DIA 扫描。 11. 高 pH 逆转阶段 C18 分馏为库生成 注：池 EPS-尿液代表样品的量大于 10 μg，以便通过以下程序构建一个数据依赖库，用于 DIA 分析： 将肽混合物（11μg）酸化0.2%的TFA，并将由此产生的溶液加载到装有两层提取盘的C18 StageTip上，以增加容量。我们估计单个微盘（从16个仪表注射器针）的装载能力在5-10微克范围内。 C18 净化所述的条件和均衡的静止阶段。 使用含有 0.2% 氢氧化铵、10 m TEAB 的 elution 溶液，从高 pH 逆转阶段 C18 逐步进行肽分馏 （n=10），并增加 ACN 的 v/v 浓度（4%、8%、12%、16%、20%、24%、28%、32%、40%、80%）。 使用 DIA 方法的相同色谱参数分析 10 个分数。使用先前用于初步分析的设置在 DDA 模式下操作质谱仪（参见”使用 DDA 分析按外部标准进行蛋白质定量”）。 12. 数据分析 通过导入专用于 DIA 分析的软件中高反转阶段 C18 分馏的 DDA LC-MS/MS 实验中获得的蛋白质识别结果，生成光谱库。 将用于识别和量化的碎片离子的最小和最大数量分别设置为 3 和 6。将获得的结果按 0.01 的 Q 值筛选。 导入 DIA 原始文件并关联到每个原始文件，与创建光谱库所用的相同的 FASTA 文件。 将用于蛋白质定量的独特肽的最小和最大数量分别设置为 1 和 10。 通过总结片段离子峰值区域来计算每个蛋白质的强度。 生成具有每个样本中量化蛋白质强度的基质。