Peptidi di screening che attivano MRGPRX2 utilizzando cellule HEK ingegnerizzate

I mastociti sono parte integrante del sistema immunitario e svolgono un ruolo cruciale nelle risposte immunitarie sia innate che adattative. I mastociti sono attivati principalmente dal legame di un antigene al complesso immunoglobulina E (IgE) – recettore FcεRI, o dal recettore della proteina G correlato a mas recentemente scoperto-X2 (MRGPRX2)¹. L’attivazione di MRGPRX2 è stata collegata a diverse malattie immunitarie e infiammatorie e, quindi, è importante comprendere il meccanismo di legame del recettore ai suoi ligandi². Per fare ciò, è stata sviluppata una libreria di piccole molecole peptidiche e sottoposte a screening contro i recettori MRGPRX2 che sono stati sovraespressi nelle cellule HEK. Nello studio, la libreria peptidica è stata costruita utilizzando le tecniche semplici e versatili della scansione dell’alanina e del troncamento degli amminoacidi. La scansione dell’alanina comporta la sostituzione di aminoacidi specifici con un residuo di alanina. Essendo l’alanina piccola e neutra, spoglia il peptide delle proprietà specifiche conferite dal residuo sostituito ed evidenzia consecutivamente il significato delle rispettive proprietà fisiochimiche dell’amminoacido nelle interazioni recettoriali. Al contrario, nel troncamento degli amminoacidi, le sequenze peptidiche sono progettate in modo tale da mancare uno o più residui di amminoacidi dal terminale N, dal terminale C o da entrambi. Questo insieme di peptidi è stato utilizzato per identificare le sequenze di aminoacidi cruciali per il legame con MRGPRX2.

L’esperienza con le linee di mastociti umani (LAD-2) ha dimostrato che queste cellule sono difficili da coltura e mantenere in vitro:un tempo di raddoppio di due settimane, costosi integratori medi e attenzione diretta richiesta durante il passaggio³. Questi attributi rendono le cellule inadatte per lo screening su larga scala di potenziali ligandi. Qui, le cellule HEK stabilmente trasfettate che esprimono il recettore MRGPRX2 (HEK-X2) sono state utilizzate per lo screening della libreria peptidica¹. Le cellule HEK-293 sono ampiamente utilizzate e studiate per l’espressione eterologa dei recettori di superficie grazie alla loro elevata efficienza di trasfezione, al tasso di raddoppio più veloce e alla necessità di integratori medi non costosi da colturare in laboratorio⁴. Il protocollo per trasfezionare la linea cellulare HEK-293 è stato dimostrato ed è ben consolidato⁵. Le cellule HEK-293 che esprimono stabilmente il recettore MRGPRX2 (passaggio 13-19) sono state attivate con i peptidi generati attraverso N-troncamento, C-troncamento, N + C-troncamento e scansione alanina¹. Le celle HEK di tipo selvaggio (HEK-WT) (passaggio 16-21) sono state utilizzate come controllo. Il rilascio intracellulare di calcio al momento dell’attivazione è stato monitorato per studiare l’attivazione basata su MRGPRX2.

L’attivazione cellulare da parte di MRGPRX2 è seguita da una mobilizzazione citosolica del calcio. Questo rilascio intracellulare regolato di calcio nei mastociti è regolato dall’ingresso di calcio gestito dal deposito (SOCE), coordinato dalla molecola di interazione stromale 1 (STIM1); ed è centrale per la cascata di risposta immunitaria^6,7. Sono stati utilizzati vari metodi per rilevare la concentrazione intracellulare di calcio, tra cui patch-clamp e coloranti fluorescenti⁸. Di tutte le tecniche disponibili, i coloranti fluorometrici di calcio in coniugazione con varie tecniche di rilevamento vengono ampiamente utilizzati⁹. Due tipi di coloranti fluorometrici che hanno guadagnato interesse sono vale a dire, coloranti a singola lunghezza d’onda come Fluo-4 e coloranti ratiometrici a doppia lunghezza d’onda come Indo -1 e Fura-2. Il vantaggio che i coloranti ratiometrici a doppia lunghezza d’onda portano rispetto ai coloranti a singola lunghezza d’onda è che i coloranti ratiometrici correggono errori sperimentali come il caricamento del colorante, lo sbiancamento fotografico e la messa a fuoco^10,11.

L’estere acetossimetilico fura-2 (Fura-2 AM) è un colorante permeante cellulare, verde-fluorescente la cui eccitazione si sposta su una lunghezza d’onda inferiore dopo il legame con il calcio. Sperimentalmente, Fura-2 è eccitato a 340 e 380 nm, mentre l’emissione è registrata a 510 nm. Al momento del legame con il calcio, l’intensità fluorescente a 340 nm aumenta mentre quella di 380 nm diminuisce, come mostrato nella Figura 1. I dati sono rappresentati come un rapporto tra l’intensità di fluorescenza dopo l’eccitazione a 340 nm (F340) e quella dell’intensità dopo l’eccitazione a 380 nm (F380), cioè F340 / F380. Il rapporto F340/F380 è proporzionale al calcio intracellulare, il cui valore può essere calcolato dall’equazione di Grynkiewicz¹². Poiché il segnale di fluorescenza è ottenuto dall’eccitazione del colorante a due lunghezze d’onda (340 nm e 380 nm), il rapporto dei segnali di fluorescenza corregge fattori sperimentali come il carico del colorante, la perdita di colorante, il fotosciviazione e le densità cellulari.