단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

1. 그리드 바이트로피케이션 참고: 1단계와 2단계의 모든 단계의 경우, 모든 공구가 깨끗하고 건조하며 실온에서 LN2 온도로 냉각하여 새로 탈포된 LN2 를 사용하여 얼음 오염을 줄이십시오. 가능한 경우 습도가 < 20%의 상대 습도를 갖춘 습도 제어 환경에서 작업할 수 있습니다. 작업을 시작하기 전에 적절한 개인 보호 장비및 H&S 문서가 마련되어 있는지 확인하십시오. 관심 있는 표본이 시료 준비를 위한 준비가 되었는지 확인하십시오. 적절한 극저온EM 그리드를 선택하고 이러한 전력 병전을 통해 광방전 또는 플라즈마 처리를 사용하여 친성성으로 렌더링되었는지 확인하십시오. 프로토콜에 대한 다양한 시스템 및 변형을 사용할 수 있지만, 모든 시스템에 특정 가스 혼합물/화학 증기 또는 공기를 도입하기 전에, 원하는 진공 수준으로 챔버를 펌핑 할 프로그램을 실행하는 광선 방전 / 플라즈마 청소 시스템에 그리드를 배치포함. 전류는 가스 입자를 이온화하고 그리드의 표면을 유도하여 시스템을 통과하여 더 많은 친수성으로 렌더링됩니다. 뒷면의 전원 스위치를 사용하여 시스템을 켜고 터치 스크린이 로드될 때까지 기다립니다. 콘솔 에서 제공된 스타일러스 또는 핑거를 사용하여 챔버의 원하는 작동 온도를 설정합니다(대부분의 거대 분자4-6°C에 권장되는 범위는 4-60°C입니다). 가습기 의 바닥에 고무 튜브를 통해 주사기를 사용하여 50 mL 유형 II 실험실 물로 가습기를 채웁니다. 충전하기 전에 주사기에 갇힌 공기를 제거하십시오. 가습기나 물이 챔버로 흘러 들어가는 것을 과도하게 채우지 않도록 주의하십시오. 가습기가 채워지면 주사기 플런저를 5-10mL로 다시 끌어서 진공 씰을 만듭니다. 콘솔에서 챔버에 대해 원하는 상대 습도를 설정하십시오(사용 가능한 범위는 0-100%, 습도95-100%는 일반적으로 사용됩니다). 챔버가 너무 젖지 않도록 그리드 만들기 직전까지 습도를 ‘끄기’로 설정하십시오. 패드에 맞게 올바른 크기로 절단된 플런지 동결 장치 핀셋 및 필터 용지를 구입하거나 스탬프를 사용하여 적절한 크기의 조리개를 자릅니다. 동결을 위해 극저온을 준비합니다. 금속 냉동 그리드 박스 홀더, 저온컵, 금속 거미의 다리를 냉각수 용기에 넣습니다. LN2로 외부 챔버를 채우면 용기를 식힙니다. 외부 챔버를 얹어 극저온 그리드 박스 홀더의 상단을 덮습니다. LN2 온도에 시스템의 평형을 돕기 위해 극저온 컵에 LN2를 추가1cm추가합니다.참고: 오염 방지 링은 극저온 컵 주위의 습한 공기 응축을 제한하고 극저온 냉각수/에탄 오염으로 이어지는 데 사용할 수 있습니다. 습도 제어 환경에서는 일반적으로 필요하지 않습니다. 오염 방지 링을 사용하는 경우 LN2 로 용기를 덮치지 않도록 주의하거나 나중에 링이 용기에 밀어 넣을 때 유출될 수 있습니다. 거미 다리의 끓는 것을 관찰하기 위해 3-5 분 기다린 다음 극저온 컵이 충분히 추워서 유리화 매체를 응축할 수 있도록 3 분 더 기다립니다. 극저온(액체 에탄)을 극저온 컵에 액화합니다. 얇은 튜브와 노즐이 있는 에탄 실린더 파이프를 타고 가스를 분배합니다. 면도날을 사용하여 바로 팁을 잘라서 개구가 열린 P200 파이펫 팁이 이상적입니다. 팁에서 에탄이 고화되고 가스의 흐름을 차단하는 데 더 넓은 조리개가 필요합니다. 저온질 컵에 남은 LN2가 포함되어 있지 않도록 하고, 에탄 가스 노즐을 가지고 저온질 컵 내에 놓습니다. 가스 실린더 레귤레이터를 사용하여 낮은 흐름을 시작하고 극저온 가스를 극저온 컵에 분배하여 가스를 응축시합니다. 가스가 극저온 컵의 벽에 직접 누르면 흐르는 팁을 유지하지만 표면에 대한 두드리는 움직임으로 부드럽게 앞뒤로 움직입니다. 저온유류가 극저온컵 내에서 제어된 방식으로 응축/액화되기 시작할 수 있도록 가스의 흐름을 조절한다. 컵을 은 거미 림 바로 아래에 채우고 가스 흐름을 중지한 다음 가스 라인을 조심스럽게 제거하여 주변 LN2 를 에탄으로 오염하지 않도록 하십시오. LN2로 냉각수 용기를 위로 올려 액체 에탄에 흘리지 않도록 주의하십시오. 액체 에탄이 충분히 차가운 온도에 평형되도록 – 3-5 분 동안 거미 다리를 배치합니다. 저온은 흐리고 약간 불투명해 보이기 시작합니다. 이는 동결 점에 가깝다는 것을 나타냅니다. 이 단계에서 는 핀셋을 사용하여 거미를 제거하십시오. LN2 가 극저온 컵을 둘러싼 용기 내에 보관되는 한, 에탄은 이제 액화되어 1-2h의 유리화에 적합합니다. 그러나, 얼음 오염을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 절차를 완료하는 것을 목표로, 특히 비 습도 제어 실에서.참고: 거미가 ‘붙어 있는’ 것처럼 보이는 경우 너트와 같은 금속 물체를 사용하여 거미의 다리에 대고 약간 따뜻하게 한 다음 다리를 제거합니다. 시료 진동을 위해 플런지 동결 장치 및 액세서리를 준비합니다. 금속 냉동 그리드 박스 홀더에 그리드 스토리지 박스를 추가하고 절차 전반에 걸쳐 LN2 가 그리드 박스 의 수준 바로 위에 올려져 있는지 확인합니다(일반적으로 모든 ~ 5분). 플런지 동결 장치 화면에서, 프로세스 매개 변수 상자에서 선택한 매개 변수입력: blot 시간 (플런지 동결 장치 패드가 함께 올 시간), 힘 (그리드에서 블로팅 패드의 거리, 이는 얼음 형성의 그라데이션을 변경) 및 총 (블로팅 패드가 충족될 횟수). 거대 분자의 개별 급락 동결 장치 및 행동에 따라 이러한 매개 변수를 선택합니다. 일반적인 값은 0과 5 사이의 얼룩력, 1-6 s에서 의 blot 시간 및 1의 얼룩 총입니다. 일반적인 대기 시간(블롯 을 시작하는 시간, 그리고 블롯 시작 사이의 시간)과 배수 시간 (급락 하기 전에 블로팅 후 시간)는 0-2 s입니다.참고: 사용자 선호도에 따라 옵션의 추가 옵션 , 각 프레스의 다음 단계로 이동하는 풋 페달 사용 , 그리드 전송 건너뛰기 (트위저 암이 약간 발생하는 마지막 단계를 건너뛰기), 프로세스 중 습도 끄기 (샘플이 적용되는 동안, 그리드를 보기 어렵게 만들 수 있는 챔버의 활성 가습 을 중지) 및 자동 리프트 의 활성 가습을 중지하는 등 옵션의 추가 옵션을 선택할 수 있습니다. (챔버로 들어올려지고 냉각수 용기를 올리는 핀셋의 단계를 결합하여 에 탄 용기 단계를 높 입니다). 여기서이러한 모든 옵션이 켜져 있습니다. 냉각수 용기를 챔버 아래 움직이는 플랫폼 암에 단단히 놓습니다. 플라스틱 링 클립이 고정되도록 각 블로터 암에 신선한 블로팅 용지를 삽입합니다. 각 필터 용지는 16개의 블롯(팔회전 용지)을 허용합니다. 컨트롤 섹션에서 Blot 용지 재설정 버튼을 누릅니다. 플런지 동결 장치 진동 프로세스의 전체 주기 1개를 실행하여 각 이동 부품이 예상대로 작동하도록 합니다. 누릅니다(또는 풋 페달을 사용하여 새 그리드를 배치한 다음 프로세스를 시작한 다음 계속 처리합니다. 이 단계에서는 블로팅 암이 예상대로 서로 접촉하고 있는지 확인하십시오. 가습기를 ‘켜십시오’. 수증기가 생성됩니다 (설정 습도가 현재 챔버에서보다 높은 한). 관심있는 표본은 이제 유리화 될 수 있습니다. 풋 페달 또는 뉴 그리드 배치 를 사용하면 플런징 로드가 챔버밖으로 내려와 핀셋을 마운트에 부착할 수 있습니다. 플런지 동결 장치 핀셋을 사용하여, 그리드 제조업체에 따라 샘플 응용 프로그램에 사용할 올바른 측면이 무엇인지 주의하여 원하는 광선 방전/플라즈마 청소 극저온엠 그리드를 선택하십시오. 이 지원이 손상됩니다으로 핀셋과 과도 / 불필요한 접촉을 방지하기 위해주의, 림에 의해 그리드를 선택합니다. 핀셋의 능선 부분으로 검은 클립을 이동하여 핀셋의 격자를 확보합니다. 그리드를 안전하게 유지해야 하지만 클립이 블로팅 패드에 접촉하므로 너무 멀리 내려서는 안되며, 나중에 클립을 해제할 때 핀셋을 이 지점 아래에 두어야 합니다. 극저온EM 그리드를 들고 있는 플런지 동결 장치 핀셋을 공압 암에 놓고 올바른 면을 지배적인 손을 향하게 합니다. 플런지 동결 장치 핀셋 및 챔버의 설계는 사용자의 손에 따라 챔버의 오른쪽 또는 좌측을 통해 시료를 적용할 수 있도록 한다.참고: 동일한 블로팅 매개 변수로 다른 측면에 샘플을 적용하면 비교 결과가 거의 발생하지 않으므로 왼손잡이 연구원은 오른손잡이 동료와 독립적으로 블로팅 매개 변수를 조정해야 할 수 있습니다. 프레스 스타트 프로세스 와 핀셋에 보관된 그리드는 챔버로 이동하여 냉각수 용기가 들어올 것입니다. 프레스 프로세스 와 핀셋은 파이펫을 사용하여 시편을 그리드에 적용할 수 있는 위치로 그리드를 이동합니다. 그리드의 올바른 측면을 향한 측면 포트를 열고 파이펫팅으로 샘플을 적용하여 파이펫 팁이 그리드 지지/구부러짐의 손상으로 이어질 수 있으므로 그리드에 닿지 않도록 하지만 액적이 그리드에 분배되도록 액체를 충분히 가까이 분배합니다. 일반적으로 3-5 μL이 적용됩니다. 계속 및 사용자 미리 정의된 매개 변수는 그리드를 얼룩진 다음 샘플 진동을 위해 냉각수 컵에 장착된 그리드로 핀셋을 급락시합니다. 핀셋은 냉각수 용기와 냉각수를 들고 있는 팔과 함께 하강하여 극저온에 그리드를 침수합니다. 극저온 컵에서 LN2에 잠긴 그리드 스토리지 박스로 그리드를 전송합니다. 핀셋을 핀셋팔에서 분리하고, 극저온 컵의 측면과 유리화 격자에 연락하지 않도록 세심한 주의를 기울입니다. 핀셋을 편안하게 유지되도록 그립을 조정합니다. 가능한 한 빠르고 신중하게 그리드를 극저온에서 LN2 로 이동합니다. 한 손으로는 핀셋을 손가락으로 닫고 다른 손으로 는 검은 색 클립을 길에서 위쪽으로 밀어 핀셋을 닫습니다. 그립을 재조정하고 그리드 스토리지 상자에 그리드를 조작합니다. 모든 그리드가 만들어질 때까지 1.10-1.19 단계를 반복합니다(일반적인 세션에는 4-12 그리드 만들기가 포함됩니다). 다음 단계까지 LN2 디워에 그리드가 포함된 모든 그리드 스토리지 박스를 저장합니다. 2. 자동 로더 현미경으로 로딩을위한 그리드 클리핑 이전에 설명된 프로토콜 (28)에 따라 자동 그리드 어셈블리로 그리드를 클립합니다. 3. 현미경에 원격 로그인 을 보안 참고: COVID-19는 글을 쓰는 시점에 제어할 수 있지만 해외 여행과 관련된 환경 적 문제로 인해 사용자가 원격으로 운영되는 서비스를 제공하는 더 많은 현미경 시설이 있습니다. 이를 위한 구현 방법은 각 시설의 로컬 IT 구성 및 내부 및 외부 사용자 커뮤니티의 요구에 따라 달라집니다. 여기서 eBIC에서 극저온에 원격으로 액세스하고 EPU 소프트웨어를 통해 현미경을 제어하는 과정이 설명되어 있습니다. 극저온에 원격으로 로그인합니다. 원격 로그온은 NoMachine 소프트웨어를 통해 현미경 지원 PC에 액세스하도록 중재되며 사용자 FedID 로그온 자격 증명을 통해 방문시 등록된 사용자에게만 액세스할 수 있도록 구성됩니다. 세션 기간 동안만 액세스가 활성 상태로 유지됩니다. NoMachine을 열고 암호 인증으로 nx-cloud.diamond.ac.uk 대한 새로운 NX 연결을 시작합니다. 연결을 열고 사용자 이름 fedid@fed.cclrc.ac.uk 및 FedID 암호로 로그인합니다. 사용 가능한 옵션에서 관련 현미경에 해당하는 아이콘을 두 번 클릭하여 관련 지원 PC에 대한 연결을 엽니다. Windows 로그온 화면에서 사용자 이름 clrc\FedID및 암호를 입력합니다. 데스크톱 아이콘에서 TeamViewer 소프트웨어를 열고 제공된 암호가 있는 파트너ID: TEM에 연결합니다. 이렇게 하면 지원 PC에서 TEM PC로의 연결이 설정됩니다. TeamViewer 리본의 다음 모니터 버튼을 사용하여 현미경 사용자 인터페이스와 EPU 창 사이를 전환할 수 있습니다. 현미경 기능은 EPU 인터페이스를 통해 사용자가 직접 제어할 수 있습니다. 4. 샘플을 자동 로더 현미경으로 적재하고 얼음 및 샘플 품질을 위한 스크리닝 참고: 이 섹션에서는 자동 로더 및 EPU 소프트웨어가 있는 현미경이 샘플 스크리닝에 사용되지만 다른 소프트웨어 및 측면 진입 시스템 및 다른 제조업체의 저온을 사용하여 이를 달성할 수 있습니다. 이전에 설명된 바와 같이 하중은 현미경 자동 로더에 그리드를 클리핑28. 현미경 사용자 인터페이스의 자동 로더 탭에서 화살표를 사용하여 옵션 대화를 탭하고 인벤토리 버튼을 누릅니다. 이렇게 하면 카세트의 각 위치를 순차적으로 검사하여 카트리지가 있는지 확인합니다. 점유 슬롯은 파란색으로 표시됩니다. 점유된 슬롯이 모두 매핑된 경우 인벤토리 버튼을 다시 눌러 현재 위치 후에 중지하고, 점유된 모든 슬롯이 매핑될 때까지 실행 상태로 둡니다. 제공된 상자에 샘플 세부 정보가 있는 모든 점유 슬롯에 레이블을 지정합니다. 현미경 열로 전송할 그리드를 강조 표시하고 로드를 클릭 합니다. 그리드가 성공적으로 스테이지에 로드되면 슬롯 레이블이 파란색에서 노란색으로 바뀝니다. 그리드를 스크리고 진행합니다. EPU 소프트웨어를 엽니다. 준비 페이지에서 획득 광학 및 설정을 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 Atlas 사전 설정을 선택합니다. 적절한 빔 설정 사전 설정(예: 64x 명목 매그, 스팟 크기 5, Microprobe, 팔콘 검출기의 병렬 범위에 조명 된 영역을 선택하십시오-빔 설정 사전 설정 see28을 선택하는 추가 정보를 위해). 매개 변수를 현미경으로 밀어 넣도록 설정 서를 누릅니다. 열 밸브를 열고 FluScreen을 삽입합니다. 빔이 표시되고 충분히 확산되고 검출기를 덮을 중앙에 있는지 확인합니다. 필요한 경우 조이스틱 또는 스테이지 메뉴를 사용하여 그리드의 더 얇은 영역으로 이동하여 X및 Y의 스테이지 이동을 제어합니다. FluScreen을 들어 올리고 EPU의 미리 보기 버튼을 사용하여 이미지를 찍습니다. 획득된 이미지에 기초하여, 더 낮은 수 스팟 크기로 이동하여 용량을 증가시킬 수 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. EPU에서 아틀라스 페이지로 이동하여 새 세션을 누릅니다. MRC 이미지 형식을 선택하고 스크리닝 세션을 저장하기 위한 적절한 폴더 이름과 위치를 입력한 다음 적용을 클릭합니다. 왼쪽의 메뉴에서 스크리닝 을 선택합니다. 각 그리드 옆에 있는 확인란을 선택하여 아틀라스 몽타주를 획득합니다. EPU에서 스크리닝 세션을 시작합니다 . 각 확인 그리드에 대해 아틀라스가 획득되며 완료 시 사용 가능한 여러 그리드 사각형이 나열됩니다. 각 아틀라스는 스크리닝 페이지에서 강조 표시하여 볼 수 있으며, 색상별로 그룹화된 유사한 예상 얼음 두께로 그리드 사각형을 표시하는 마크업이 완료됩니다. 완료되면 수집된 아틀라스를 검토하고 더 높은 배율에서 샘플 품질을 평가하는 데 적합한 그리드를 식별합니다(즉, 두꺼운 얼음으로 건조하거나 가려지지 않는 적절한 수의 그리드 사각형을 가진 그리드 제곱). EPU 스크리닝 메뉴에서 선택한 그리드를 강조 표시하고 로드 샘플을 클릭합니다. 빔 설정 사전 설정(각 스테이지에 원하는 빔 설정 사전 설정에 대한 설명 28 참조)과 미리 보기 기능을 사용하여 원하는 그리드 사각형을 보다 자세하게 검사합니다. 아틀라스 스크리닝 메뉴에서 현재 로드된 그리드를 선택하고 그리드 이미지의 원하는 위치를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 그리드 사각형으로 이동을 선택하여 채워진 구멍이 포함된 그리드 사각형으로 스테이지를 이동합니다. EPU, 준비 페이지로 돌아가그리드스퀘어 사전 설정을 선택합니다. EPU, 자동 함수 페이지를 열고 GridSquare 사전 설정으로 단계 기울기로 자동 유중심을 실행하여 샘플을 동심 높이로 이동합니다.참고: 빔 기울기에 의한 자동 유중심성도 사용할 수 있으며, 이는 스테이지 기울기에 의한 자동 유중심보다 빠르지만 일반적으로 덜 정확합니다. EPU에서 준비, 새로운 GridSquare 미리 보기 이미지를 가져 가라. 다른 얼음 두께를 나타내는 다른 구멍에 걸쳐 다른 회색 값을 유의하십시오. 오른쪽 클릭을 사용하여 구멍 위로 스테이지를 이동> 여기로 이동합니다. 구멍/유중심 높이 사전 설정 및 미리 보기를 선택합니다.참고: 관심 있는 입자의 분자량 및 형상에 따라 구멍/유중심 높이 배율에서 이를 식별할 수 있습니다. 데이터 수집 사전 설정을 선택하고 파티클을 쉽게 식별할 수 있는 배율을 설정합니다(일반적으로 <2å/pixel의 개체 샘플링에 해당). defocus 오프셋을 ~-40-80 e-/Å2의 노출 전자 용량으로 ~-3 ~ -5 μm로 설정합니다. 4.4의 단계를 반복하여 그리드 전체의 입자 분포, 방향 및 오염에 대한 다양한 얼음 두께를 평가합니다. 파티클 분포는 구멍의 중심에 비해 가장자리에 가깝게 다를 수 있으므로 구멍이 있는 다른 위치를 조사하는 것이 중요합니다. 아틀라스의 약속을 표시하는 모든 그리드를 충분한 그리드 사각형을 갖는 것으로 화면. 현미경에 이들을 유지하고 EPU를 사용하여 데이터 수집을 진행하거나, 현미경에서 샘플을 언로드하고 데이터 수집이 예약될 때까지 LN2 아래에 저장합니다. 5. 단일 입자 극저온 데이터 수집(원격 작업에 중점을 둔) 참고: EPU를 사용하여 데이터 수집을 위한 자세한 프로토콜은 제조업체 매뉴얼 및 기타 28에 설명되어 있습니다. 원격 작업을 위한 이 프로토콜의 수정(즉, 작업을 수행하기 위해 손 패널의 사용을 줄이고 소프트웨어 기반 대안을 사용하는 경우)이 강조 표시됩니다. 세션 중에 이미 수집되지 않는 한 그리드에 대한 아틀라스를 수집합니다. 프로젝트의 실험 적 요구에 따라 각 빔 설정 사전 설정을 정의합니다. 이미지 시프트 보정28을 수행합니다. EPU 세션을 설정합니다. EPU에서 세션 설정 후 EPU 페이지를 선택하고 새 세션을 선택한 다음 기본 설정에서 새 세션을 선택합니다. 이전 설정을 사용할 수 있는 옵션을 제공하는 팝업이 나타납니다 새 세션을 선택합니다. 예 는 이전 EPU(예: 시편 캐리어, 디포커스 범위, 자동 초점 설정, 그리드 유형)에서 현재 EPU 세션에 설정을 자동으로 로드합니다. 기본 설정에서 새 를 선택하면 사용자가 저장된 기본 설정(예: 디포커스 범위, 자동 초점 설정, 그리드 유형)이 있는 파일을 선택할 수 있으며 이 정보는 EPU로 미리 로드됩니다. 세션 이름을 유익한 것으로 채웁니다. 현지 시설에서 명명 규칙을 제안할 수 있습니다. 유형에서 수동을 선택합니다. 획득 모드의 경우 정확한 구멍 센터링 또는 빠른 획득을 선택합니다. 이미지 형식으로 원하는 형식을 선택합니다. 적절한 저장소 폴더 를 선택하고 EPU는 세션 이름으로 디렉터리를 만듭니다. 사용되는 그리드 유형 및 구멍 간격(예: 콴티포일 1.2/1.3)에 따라 적절한 시편 캐리어를 선택하고 적용을 누릅니다. 이 프로토콜은 일반 구멍 배열에 대한 템플릿을 생성하는 프로세스를 설명합니다. 초기 그리드 정사각형을 선택하고 획득 템플릿을 설정합니다.사각형 선택 이동, 모든 사각형이 녹색인 경우 왼쪽 상단에 있는 모든 선택 취소를 클릭합니다. 타일 열기(우측 클릭 > 열린 타일). 사각형을 선택합니다(마우스 오른쪽 클릭 > 추가, 마우스 오른쪽 클릭 > 그리드 정사각형으로 스테이지 이동). 구멍 선택으로 이동하여 자동 유중심을 누릅니다. 이 완료 되 고 그리드 사각형 이미지를 촬영 될 때까지 기다립니다. 자동 기능이 실패하면 높이가 크게 꺼져 있기 때문일 수 있습니다. 그렇다면 그리드 스퀘어 배율에서 FluScreen을 사용하여 수동으로 조정할 수 있습니다. 구멍 크기를 측정합니다. 노란색 원을 이동하고 조정하여 올바른 크기와 간격으로 구멍 위에 있습니다. 구멍을 찾기 를 누릅니다. 구멍이 올바르게 발견되었는지 확인합니다. 구멍 크기를 변경하지 않고 구멍을 다시 찾을 수 없습니다. 구멍을 올바르게 찾을 때까지 이 것을 반복합니다. 일관되게 실패하면 그리드 제곱 배율에서 더 낮은 숫자(밝은) 스팟 크기로 이동하는 것이 좋습니다. 오른쪽의 필터 얼음 품질 히스토그램을 사용하여 구멍 선택을 조정합니다. 이것은 두꺼운 얼음과 얇은 얼음이있는 영역을 제외하는 데 유용 할 수 있습니다. 이 세션 중에 선택한 향후 그리드 사각형에 대해 기억됩니다. 상단의 선택 메뉴의 도구로 구멍 선택을 최적화합니다. 예를 들어 그리드 막대 근처의 구멍 제거를 클릭합니다. 템플릿 정의로 이동하여 획득을 누릅니다. 찾기 및 중앙 구멍을 클릭합니다. 이제 구멍 주위에 노란색 원이 있는 구멍의 이미지가 표시됩니다.참고: 구멍을 찾기 위해 고군분투하는 경우 목표 조리개를 삽입합니다. 여전히 구멍을 찾을 수 없는 경우 구멍/유중심 높이 사전 설정에 대한 노출 시간을 늘리거나 이 사전 설정에 대한 디포커스를 늘리거나 이미지를 비우십시오. 큰 디포커스 변경은 이미지 시프트 선형을 변경할 수 있습니다. 단계 이동 후 지연을 변경하고 이미지 시프트 후 지연 시간을 1-5로 변경합니다. 최대 이미지 이동 값(옵션을 사용할 수 있는 경우)이 원하는 대로 확인합니다. 수차 없는 이미지 시프트 컬렉션을 사용하는 경우 이 값은 EPU 구성 파일에 정의되며 그렇지 않으면 5 μm이 표준 값입니다. 획득 영역 추가를 클릭한 다음 이미지의 어느 곳을 클릭합니다. 획득 영역을 원하는 위치(즉, 구멍 가장자리)로 이동하여 획득 영역이 빔으로 이중으로 노출되지 않도록 합니다(녹색 원의 사각형은 검출기 영역을 나타내고, 녹색 원은 빔 직경입니다). 오른쪽 상단에 디포커스 범위를 추가합니다. 그런 다음 다른 획득 영역을 추가합니다. 멤브레인 단백질 프로젝트의 전형적인 디포커스 목록은 -0.8 ~ -3 μm 디포커스이다. 자동 초점 추가 영역을 클릭하고 이미지의 어느 곳을 클릭합니다. 자동 초점 영역을 구멍을 둘러싼 탄소로 이동합니다. 표준 관행은 제곱편의 z 높이 변화에 따라 AFIS 또는 5-15 μm마다 중앙 집중 후 자동 초점입니다. 0.05 nm/s의 설정된 임계값을 가진 드리프트 측정 영역을 클릭하면 그리드 정사각형당 한 번 수행되는 드리프트 측정값이 표준 설정입니다. 드리프트 측정 영역은 자동 초점 영역과 직접 겹칠 수 있습니다(그리고 좋은 생각입니다). 드리프트 나 자동 초점 영역이 획득 영역과 겹치지 않도록 하십시오.참고: 템플릿 실행 함수를 사용하여 템플릿을 확인할 수 있습니다. 이것은 획득 영역이 이동해야하는 지 확인하는 것이 좋습니다 (예 : 이미지에 너무 많고 탄소가 충분하지 않음) 필요하지 않습니다. 다시 정사각형 선택으로 이동하고 그리드에서 수집을 위한 사각형을 선택합니다. 수집 영역 수와 예상 데이터 수집 률(검출기 및 실험 설정 기반 시설)을 사용하여 필요한 수집 영역 수를 예측합니다. 원하는 사각형을 모두 선택하면 모든 사각형 준비를 누릅니다. 각 사각형이 수집되면 그리드 사각형 사이를 탐색하고 선택 브러시를 사용하여 구멍을 미세 조정합니다. 시편을 통해 스테이지 위치로 이동하고 자동 기능을 사용하여 연동성 높이를 설정합니다. 이전에 설명한 대로 현미경 정렬을 수행28, 하지만 코마 없는 정렬을 수행 하 고 수동으로 객관적인 난시에 대 한 수정, 소프트웨어 내에서 정렬 도구를 사용 하 여. 간단히, 집합 획득 빔 조건, 목표 조리개 (OA)를 제거하고 단계는 유중심 높이에 표본의 빔 안정 영역 위에 위치되어 있는지 확인합니다. OA를 다시 삽입및 중심으로 하고 EPU로 객관적인 렌즈 난시를 수정하기 전에 자동 기능 내에서 혼수 상태에 관계없이 정렬을 수행합니다. 두 정렬이 적절한 값(<150nm의 혼수 상태에 수렴되고 난시가 0에 가깝게 수렴되는지 확인합니다. 자동 인수 실행을 시작하기 전에 오토로더 터보 펌프가 꺼지고 목표 조리개가 삽입되었는지 확인합니다. 자동 인수에서 시작을 눌러 자동화된 데이터 수집을 시작합니다. 6. EM 밀도 맵을 산출하는 이미지 처리 참고: 극저온시설의 대부분은 ‘즉석에서’ 마이크로그래프 영화를 사전 처리합니다. RELION 파이프라인28,33, cryoSPARC43, Scipion34 및 WarpEM44를 포함하여 다양한 소프트웨어 패키지및 접근 방식이 있습니다. RELION 기반 파이프라인은 여기에 설명되어 있으며 사용자가 계산 리소스에 액세스할 수 있는 적절한 저장소 위치로 현미경 그래프 영화를 이동했다고 가정합니다. 멤브레인 단백질 프로젝트에 대한 공정 및 대표 결과에 대한 개요가 제공되며, 자세한 설명 및 단계별 튜토리얼은 리리온 홈페이지에서 찾을 수 있습니다: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion. 현미경 동작 보정 및 CTF 추정에 대한 ‘즉석’ 분석을 수행합니다. 프로젝트 디렉터리 내에서 리릴리온을 시작합니다. 가져오기, 모션 보정 및 CTF 추정 작업을 데이터 수집 및 전송과 동시에 반복하도록 예약합니다. 마이크로그래프 분석 script28은 난시에 대한 실시간 시각적 피드백과 예상 디포커스 값(대표 결과 참조)을 제공합니다. 미리 처리된 현미경 그래프에서 파티클을 선택합니다. 선택할 수 있는 자동화된 파티클 따기 소프트웨어 패키지가 많이 있습니다. RELION37의 자동 따기 탭 내에서 참조 무료 및 템플릿 기반 선택 옵션을 사용할 수 있습니다. 다른 프로그램은 입자 따기35에 crYOLO를 사용하여 다양한 단계에 사용될 수있다. CTF 교정 된 현미경 그래프에서 입자를 추출합니다.참고: 조기 ‘정리’에 필요한 계산 시간을 줄이기 위해 단계 처리를 처리하고 추출 시 입자를 축소/bin합니다. 추출 작업을 실행하는 방법에 대한 자세한 내용은 RELION 3.1 자습서에서 찾을 수 있습니다. 이 프로젝트의 경우 파티클은 처음에 2의 계수로 비닝되었습니다. 2D 클래스 평균을 수행합니다. 100-200개 클래스에서 분류하면 파티클 ≥ 포함하는 대부분의 데이터 집합에 적합합니다. 샘플에 대칭이 높은 경우(즉, icosahedral 바이러스)가 없는 한 데이터 집합이 작은 경우에도 200개 이상의 클래스 또는 50개 미만의 클래스를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 마스크 직경을 충분히 크게 설정하여 파티클의 가장 긴 치수를 수용할 수 있지만 인접한 파티클을 제외할 만큼 충분히 단단합니다(일부 시행 착오가 필요할 수 있음). 하위 집합 선택 작업을 사용하여 좋은 클래스(즉, 구조적 세부 정보가 있는 클래스)를 선택합니다. 양호하고 나쁜 2D 클래스 평균의 예는 대표 결과 섹션에서 찾을 수 있습니다. RELION의 3D 초기 모델 작업을 사용하여 데이터에서 초기 모델 드 노보 를 생성합니다.참고: 덜 깨끗한 입자 스택은 정크/하위 최적 입자를 선별할 수 있는 추가 기회를 제공하기 때문에 다중 참조 ab initio SGD(스토세스 그라데이션 하강) 미세 조정의 이점을 누릴 수 있습니다. 관심 있는 파티클을 수용할 수 있는 마스크 직경을 선택하고 이러한 성능이 일상적으로 잘 수행되므로 ‘SGD’ 탭의 필드의 기본 값을 그대로 둡니다. 초기 모델이 Chimera(또는 다른 적절한 시각화 프로그램)에서 합리적으로 보이는지 확인합니다(대표 결과 참조). 3D 분류를 수행하여 6.6 단계의 출력을 참조 모델로 사용하여 데이터에서 이질성을 해결합니다. 키메라의 결과 맵을 평가합니다. 고유한 형태 상태에 해당하는 공정 입자 스택은 독립적으로 처리합니다. 하위 집합 선택 작업을 사용하여 관심 있는 클래스/클래스를 선택하고 관련 파티클 스택에 대해 particle.star 파일을 생성합니다. 3D 자동 개선 실행. 이전 단계에서 얻은 3D 클래스 평균을 해당 파티클 스택의 구체화를 위한 참조로 사용합니다. 구체화의 해상도가 데이터의 나이퀴스트 한계에 가까워지면 축소 없이 파티클을 다시 추출합니다. 다시 추출한 후 비통형 입자 스택을 통해 3D 자동 정제 작업을 반복합니다. 이 경우 3D 참조 모델은 픽셀 및 상자 크기가 다시 추출된 파티클 이미지의 크기와 일치하므로 다시 조정되어야 합니다. relion_image_handler 명령줄 도구를 사용하여 이 작업을 수행합니다. 적절한 경우 정교하게 대칭을 활용하십시오. 재구성된 맵에 대칭이 있는 경우 relion_align_symmetry 명령줄 도구를 사용하여 적절한 대칭 축에 맵을 정렬합니다. 결과 정렬된 맵을 참조 탭에 지정된 적절한 대칭 연산자가 새 3D 자동 수정 작업에서 참조로 사용합니다. 3D 자동 개선에서 맵을 선명하게 합니다. 이 작업은 RELION에서 후처리 작업을 사용하여 수행되지만 먼저 정제된 맵에서 적합한 마스크를 만들어야 합니다. 마스크 생성 및 후처리 단계는 RELION 자습서에 자세히 설명되어 있습니다(대표적인 결과 참조).참고: 리온의 베이지안 연마 및 CTF 정제 기능을 사용하여 많은 재건의 해상도를 더욱 개선할 수 있습니다. CTF 정제 작업 유형을 사용하여 더 높은 수차(빔 기울기, 트레포일 수차 및 4차 수차)를 추정하고 수정하고 별도의 작업, 위행성 배율 및 입자당 디포커스로 보정합니다. 이에 따라 Bayesian 연마 작업(숙련된 값 또는 기본 값)을 사용하여 입자당 빔 유도 모션을 해결합니다. RELION 3.1 자습서에서 언급된 바와 같이, 이러한 작업은 반복적 인 접근 방식 (CTF- 정제 → 베이지안 연마 → 3D 자동 정제 → 후처리 → 혜택을 누릴 수 있습니다 … 루프) 둘 다 고해상도 모델의 이점을 누릴 수 있기 때문에. 필요한 경우 EM 밀도 맵의 핸드를 수정합니다. 맵을 검사하여 기존 원자 모델에 맞게 시도하거나 알파 헬리칼 영역의 손수를 평가하여 손이 올바른지 여부를 결정합니다. 필요한 경우 ‘vop zflip’ 명령을 사용하여 UCSF Chimera45의 z축을 따라 맵을 뒤집습니다.