Análise das respostas e identificação de epítopos de células T T específicas do HBV com base em uma matriz de peptídeos
概要
Com base em uma matriz de peptídeos derivadas do vírus da hepatite B (HBV), as respostas de células T CD4 específicas do HBV poderiam ser avaliadas em paralelo com a identificação de epítopos de células T CD4 específicas do HBV.
Abstract
As células CD4 T desempenham papéis importantes na patogênese da hepatite crônica B. Como uma população celular versátil, as células CD4 T foram classificadas como subconjuntos funcionais distintos com base nas citocinas que secretaram: por exemplo, IFN-γ para células auxiliares CD4 T 1, IL-4 e IL-13 para cd4 T helper 2 células, IL-21 para células auxiliares foliculares CD4 T e IL-17 para células auxiliares CD4 T 17. A análise das células CD4 T específicas do vírus da hepatite B (HBV) baseadas na secreção de citocinas após a estimulação de peptídeos derivados do HBV poderia fornecer informações não apenas sobre a magnitude da resposta cd4 t-cell específica do HBV, mas também sobre os subconjuntos funcionais das células CD4 T específicas do HBV. Novas abordagens, como transcrição e análise de metabolômica, poderiam fornecer informações funcionais mais detalhadas sobre células CD4 T específicas do HBV. Essas abordagens geralmente requerem isolamento de células CD4 T específicas do HBV viáveis com base em multimers complexos de histocompatibilidade de peptídeos-maior-ii, enquanto atualmente as informações sobre epítopos de células T CD4 específicas do HBV são limitadas. Baseado em uma matriz de peptídeos derivadas do HBV, um método foi desenvolvido para avaliar as respostas de células T CD4 específicas do HBV e identificar epítopos de células T específicas do HBV simultaneamente usando amostras de células mononucleares de sangue periféricos de pacientes crônicos de infecção por HBV.
Introduction
Atualmente, existem 3 abordagens principais para analisar células T específicas de antígeno. A primeira abordagem é baseada na interação entre o receptor de células T e o peptídeo (epítope). As células T específicas de antígenos podem ser diretamente manchadas com multimers complexos de histocompatibilidade (MHC) de peptídeos. A vantagem deste método é que ele poderia obter células T viáveis específicas de antígeno, adequadas para análise de transcrição/metabolômica a jusante. Uma limitação deste método é que ele não poderia fornecer informações sobre toda a resposta de células T a um antígeno específico, pois requer peptídeos de epítope validados enquanto o número de epítopos identificados para um antígeno específico é limitado por enquanto. Em comparação com os epítopos de células T CD8 específicas do vírus da hepatite B (HBV), foram identificados menos epítopos de células T específicas do HBV, foram identificados simptos de células T específicas do HBVatualmente.
A segunda abordagem baseia-se na regulação de uma série de marcadores induzidos por ativação após a estimulação do peptídeo de antígeno3. Os marcadores comumente usados incluem CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Este método tem sido usado agora para analisar respostas de células T específicas de antígeno em indivíduos vacinados5,6, pacientes com infecção por vírus da imunodeficiência humana7, e síndrome respiratória aguda grave Coronavirus 2 pacientes infecção8,9. Ao contrário do ensaio baseado em multimers peptídeo-MHC, este método não é restrito por epítopos validados e poderia obter células viáveis para análise a jusante. Uma limitação deste método é que ele não poderia fornecer informações sobre o perfil citocina de células T específicas de antígeno. Além disso, a expressão desses marcadores induzidos por ativação por algumas células não específicas de antígeno ativado pode contribuir para os sinais de fundo na análise, o que pode ser um problema especialmente quando as células T específicas de antígeno alvo são raras. Atualmente, há uma aplicação limitada deste método em células CD4 T específicas do HBV4. Se esse método poderia ser utilizado para analisar células CD4 T específicas do HBV de forma confiável, precisa de uma investigação mais aprofundada.
A terceira abordagem é baseada na secreção de citocinas após a estimulação do peptídeo de antígeno. Como a análise baseada em marcadores induzidos por ativação, este método não é restrito por epítopos validados. Este método poderia revelar diretamente o perfil de citocinas de células T específicas de antígeno. A sensibilidade deste método é menor do que o método baseado em marcador induzido por ativação, pois se baseia na secreção de citocinas de células T específicas de antígeno e o número de citocinas testadas é geralmente limitado. Atualmente, este método é amplamente utilizado na análise de células T específicas do HBV. Como citocinas que secretam células T específicas do HBV dificilmente poderiam ser detectadas pela estimulação direta de peptídeo ex vivo10,11, o perfil citocina das células T específicas do HBV é geralmente analisado após 10 dias de expansão estimulada por peptídeo in vitro12,13,14,15,16. O arranjo de piscinas de peptídeos em forma matricial tem sido utilizado para facilitar a identificação de epítopos específicos de antígeno17,18. Com a combinação de matriz de peptídeos e análise de secreção de citocinas, um método foi desenvolvido para avaliar as respostas específicas das células T CD4 específicas do HBV e identificar epítopos de células T específicas do HBV simultaneamente16. Neste protocolo, os detalhes deste método são descritos. O antígeno núcleo HBV é escolhido como um exemplo de demonstração neste protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
As etapas mais críticas deste protocolo estão listadas da seguinte forma: 1) PBMCs suficientes de alta viabilidade para iniciar a expansão dos PBMCs; 2) ambiente adequado para expansão de PBMCs; e 3) remoção completa de piscinas de peptídeos residuais na cultura pbmcs antes da identificação do epítope.
Toda a análise neste protocolo depende da proliferação robusta das células CD4 T. Em geral, o número de PBMCs após a expansão de 10 dias será de 2 a 3 vezes o número inicial. …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) e Chave Chinesa
Projeto Especializado em Doenças Infecciosas (2018ZX10723203).
Materials
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
参考文献
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