Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen und Identifizierung von HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen auf Basis einer Peptidmatrix
概要
Basierend auf einer von hepatitis-B-Virus (HBV) abgeleiteten Peptidmatrix konnten HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen parallel zur Identifizierung von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Epitopen ausgewertet werden.
Abstract
CD4-T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der chronischen Hepatitis B. Als vielseitige Zellpopulation wurden CD4-T-Zellen basierend auf den zytokinen, die sie sezernierten, als unterschiedliche funktionelle Untergruppen klassifiziert: zum Beispiel IFN-γ für CD4 T-Helfer-1-Zellen, IL-4 und IL-13 für CD4-T-Helfer-2-Zellen, IL-21 für CD4-T-Follikel-Helferzellen und IL-17 für CD4-T-Helfer 17-Zellen. Die Analyse von Hepatitis-B-Virus (HBV)-spezifischen CD4-T-Zellen auf der Grundlage der Zytokinsekretion nach HBV-abgeleiteter Peptidstimulation könnte nicht nur Aufschluss über das Ausmaß der HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktion geben, sondern auch über die funktionellen Untergruppen von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen. Neuartige Ansätze wie Transkriptomik und Metabolomik-Analyse könnten detailliertere funktionelle Informationen über HBV-spezifische CD4-T-Zellen liefern. Diese Ansätze erfordern in der Regel die Isolierung lebensfähiger HBV-spezifischer CD4-T-Zellen auf der Grundlage von Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex-II-Multimeren, während derzeit die Informationen über HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope begrenzt sind. Basierend auf einer HBV-abgeleiteten Peptidmatrix wurde eine Methode entwickelt, um HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen zu bewerten und HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope gleichzeitig unter Verwendung peripherer mononukleärer Blutzellproben von chronischen HBV-Infektionspatienten zu identifizieren.
Introduction
Derzeit gibt es 3 Hauptansätze zur Analyse antigenspezifischer T-Zellen. Der erste Ansatz basiert auf der Interaktion zwischen dem T-Zell-Rezeptor und dem Peptid (Epitop). Antigenspezifische T-Zellen könnten direkt mit Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Multimeren gefärbt werden. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie lebensfähige antigenspezifische T-Zellen erhalten könnte, die sich für die nachgelagerte Transkriptomik/Metabolomik-Analyse eignen. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie keine Informationen über die gesamte T-Zell-Reaktion auf ein bestimmtes Antigen liefern konnte, da sie validierte Epitoppeptide erfordert, während die Anzahl der identifizierten Epitope für ein bestimmtes Antigen vorerst begrenzt ist. Im Vergleich zu Hepatitis-B-Virus (HBV)-spezifischen CD8-T-Zell-Epitopen wurden weniger HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope identifiziert1,2, was diese Methode für die Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen derzeit weniger anwendbar macht.
Der zweite Ansatz basiert auf der Hochregulierung einer Reihe von aktivierungsinduzierten Markern nach Antigenpeptidstimulation3. Zu den häufig verwendeten Markern gehören CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Diese Methode wurde nun verwendet, um antigenspezifische T-Zell-Reaktionen bei geimpften Personen5,6, Human Immunodeficiency Virus Infektion Patienten7und Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infektion Patienten8,9zu analysieren. Im Gegensatz zum Peptid-MHC-Multimer-basierten Assay ist diese Methode nicht durch validierte Epitope eingeschränkt und könnte lebensfähige Zellen für die nachgelagerte Analyse erhalten. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie keine Informationen über das Zytokinprofil antigenspezifischer T-Zellen liefern konnte. Auch die Expression dieser aktivierungsinduzierten Marker durch einige aktivierte Antigen-unspezifische Zellen könnte zu den Hintergrundsignalen in der Analyse beitragen, was ein Problem darstellen könnte, insbesondere wenn die Zielantigen-spezifischen T-Zellen selten sind. Derzeit gibt es eine begrenzte Anwendung dieser Methode auf HBV-spezifische CD4-T-Zellen4. Ob diese Methode genutzt werden kann, um HBV-spezifische CD4-T-Zellen zuverlässig zu analysieren, bedarf weiterer Untersuchungen.
Der dritte Ansatz basiert auf der Zytokinsekretion nach Antigenpeptidstimulation. Wie die aktivierungsinduzierte markerbasierte Analyse ist diese Methode nicht durch validierte Epitope eingeschränkt. Diese Methode könnte das Zytokinprofil von antigenspezifischen T-Zellen direkt aufdecken. Die Sensitivität dieser Methode ist geringer als die aktivierungsinduzierte markerbasierte Methode, da sie auf der Zytokinsekretion antigenspezifischer T-Zellen beruht und die Anzahl der getesteten Zytokine in der Regel begrenzt ist. Derzeit wird diese Methode häufig in der Analyse von HBV-spezifischen T-Zellen eingesetzt. Da Zytokin-sezernierende HBV-spezifische T-Zellen durch direkte ex vivo Peptidstimulation kaum nachgewiesen werdenkonnten10,11, wird das Zytokinprofil von HBV-spezifischen T-Zellen in der Regel nach 10-tägiger in vitro peptidstimulierender Expansion analysiert12,13,14,15,16. Die Anordnung von Peptidpools in Matrixform wurde verwendet, um die Identifizierung antigenspezifischer Epitope zu erleichtern17,18. Mit der Kombination von Peptidmatrix und Zytokinsekretionsanalyse wurde eine Methode entwickelt, um HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen zu bewerten und HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope gleichzeitig zu identifizieren16. In diesem Protokoll werden die Details dieser Methode beschrieben. HBV-Kernantigen wird in diesem Protokoll als Beispiel für die Demonstration ausgewählt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die kritischsten Schritte in diesem Protokoll sind wie folgt aufgeführt: 1) genügend PBMCs mit hoher Lebensfähigkeit, um die PBMCs-Expansion zu starten; 2) geeignete Umgebung für die Erweiterung von PBMCs; und 3) vollständige Entfernung von restenPtidpools in PBMCs-Kultur vor der Epitopidentifizierung.
Die gesamte Analyse in diesem Protokoll hängt von der robusten Proliferation von CD4-T-Zellen ab. Im Allgemeinen ist die Anzahl der PBMCs nach 10-tägiger Erweiterung das 2-3-fache der urs…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81930061), der Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) und Chinese Key unterstützt.
Projekt spezialisiert auf Infektionskrankheiten (2018ZX10723203).
Materials
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
参考文献
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
