Destek Yüzdürme Bloğu Kullanılarak İletim Elektron Mikroskopisinde Numune Destek Filmlerinin Hazırlanması
概要
Kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) için numune hazırlama, bu yöntemin yapı belirleme iş akışında önemli bir darboğazdır. Burada, em çalışmaları için numuneleri stabilize etmek için destek filmlerinin hazırlanması için kullanımı kolay, üç boyutlu baskılı bir blok kullanmak için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.
Abstract
Kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) ile yapı tespiti son on yılda hızla artmıştır; ancak, numune hazırlama önemli bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Makromoleküler örnekler ideal olarak ince bir vitreus buz tabakasında rastgele yönelimlerden görüntülenir. Bununla birlikte, birçok örnek buna refrakterdir ve hava-su ara arabiriminde protein denatürasyonu yaygın bir sorundur. Bu tür sorunların üstesinden gelmek için, numunelerin doldurulabileceği bir yüzey sağlamak için ızgaraya amorf karbon, grafen ve grafen oksit içeren destek filmleri uygulanabilir ve bu da parçacıkların hava-su arayüzünün zararlı etkilerini yaşama olasılığını azaltır. Bununla birlikte, bu hassas desteklerin ızgaralara uygulanması, kırılmayı, havadaki kirlenmeyi veya kapsamlı yıkama ve temizleme adımlarını önlemek için dikkatli bir kullanım gerektirir. Yakın tarihli bir rapor, destek filmlerinin doğrudan örneğe ıslatılmış aktarımını kolaylaştıran kullanımı kolay bir floatation bloğunun geliştirilmesini açıklar. Bloğun kullanımı, destek filminin fiziksel bütünlüğünü ve hidrofobik kirlenmenin tahakkuk edebileceği süreyi koruyarak gerekli manuel elleçleme adımlarının sayısını en aza indirir ve ince bir buz filminin hala üretilebilmesini sağlar. Bu makale, EM çalışmaları için karbon, grafen ve grafen oksit desteklerinin hazırlanması için adım adım protokoller sunmaktadır.
Introduction
Son on yılda, başta dedektör teknolojisi olmak üzere, diğer teknik alanlardaki atılımlar, biyolojik olarak ilgili sistemlerin iletim elektron mikroskopisi (TEM)1,2 ile görüntülenebilmesi çözünürlükte art arda önemli artışlar sağladı. Kriyo-EM’nin tek parçacık analizi (SPA) yoluyla 50 μg kadar az proteinden yüksek çözünürlüklü yapıların çözülmesine izin vermesine rağmen, kriyo-EM örneği ve ızgara hazırlığı büyük darboğazlar olmaya devam etmektedir3,4,5. SPA örnekleri, vitreus buz tabakası içinde yaklaşık rastgele dağıtılan makromoleküllerden oluşur. Parçacıklar ve çözücü arasındaki kontrast farkını en üst düzeye çıkarmak için buzun mümkün olduğunca ince olması gerekir. Biyolojik makromoleküller daha kalın buzda daha kararlıdır (yani, yerel yapılarını kaybetme olasılığı daha düşüktür), çünkü daha iyi çözülürler. Ayrıca, parçacıkların genellikle parçacık boyutundan çok daha kalın buzda görüş alanına çok daha iyi dağıldığı tespit edilir6 ve sıklıkla karbon filmlerindeki deliklerde bulunamayabilir.
Ek olarak, daha kalın buz katmanları, yüksek yüzey-hacim oranı nedeniyle moleküllerin hava-su arayüzüne yakın olma olasılığını azaltır ve kriyo-EM çalışmaları için standart dalma dondurma yöntemlerinin kullanılmasının, parçacıkların ~ % 90’ının hava-su arayüzüne adsorpsiyonu ile sonuçlandığı tahmin edilmiştir7. Daha kalın buz, çözücü içindeki saçılma olaylarının artması ve sinyalin eşlik eden zayıflaması nedeniyle istenmeyen yüksek arka planla sonuçlanır6,7. Bu nedenle mümkün olduğunca ince bir vitreus buz tabakası elde etmek gerekir; ideal olarak, katman parçacıktan sadece biraz daha kalın olacaktır. Bir ızgaraya uygulanan her farklı örnek için üstesinden gelinmesi gereken araştırmacı için zorluk, numunelerindeki parçacıkların yapısal bütünlüğünü korurken yüksek kontrastlı görüntüleme için yeterince ince örnekler hazırlamaktır. Hava-su arayüzüne protein adsorpsiyona, genellikle zararlı olan birkaç etki eşlik eder.
İlk olarak, proteinlerin bu hidrofobik arayüze bağlanması genellikle hızla ilerleyen ve tipik olarak geri dönüşü olmayan proteinin denatürasyonuna neden olan 8,9. Maya yağ asidi sinthaz kullanılarak yapılan bir çalışma, adsorbe edilen parçacıkların% 90’ına kadarının denatüre olduğunu göstermiştir10. İkinci olarak, amorf karbon11’de veya destek olmadan toplanan 80S ribozom veri kümelerinin oryantasyon dağılımını karşılaştıran bir çalışmadan elde edilen kanıtlar12, hava suyu arayüzünün hacmin 3D yeniden yapılandırılmasından ödün veren ciddi tercihli yönelime neden olabileceğini göstermiştir13. Hava-su arayüzü ile partikül etkileşimini azaltma yöntemleri arasında donma tamponunun yüzey aktif maddeler (deterjanlar gibi) ile takviyesi, destek filmlerinin kullanımı, alt tabakaların benzeşim yakalaması veya iskelelenmesi ve hızlandırılmış dalma süreleri saydır. Yüzey aktif maddelerin kullanımı kendi sorunlarıyla ilişkilidir, çünkü bazı protein örnekleri varlıklarında ideal olmayan davranabilirken, benzeşim yakalama ve iskele substratları genellikle ısmarlama ızgara yüzeyleri ve yakalama stratejileri gerektirir. Son olarak, hızlı dalma cihazlarının geliştirilmesi hakkında çok fazla araştırma olmasına rağmen14,15,16, bunlar genellikle yaygın olarak bulunmayan bir aparat gerektirir.
Biyolojik kriyo-EM için standart TEM ızgarası zaten delikli amorf karbon folyo17’ye sahip olsa da, ek destek filmlerinin üretimi ve TEM şebekelerine aktarılması için bir dizi protokol mevcuttur. Bu filmlerin kullanımı numune stabilizasyonu için köklü bir yöntemdir18. Amorf karbon destekleri, önceki raporlarda kurulan yararlı araçlar olarak floatation desteklerinin faydası ile katmanların ızgaralara yüzdürülebileceği kristal mika levhalar19 üzerinde buharlaşma ve biriktirme ile oluşturulur20. Tipik olarak Hummers yöntemi21’in değiştirilmiş bir versiyonu kullanılarak hazırlanan grafen oksit pulları, azaltılmış arka plan sinyallerinin yanı sıra makromolekülleri hareketsizleştirme ve stabilize etme yeteneği için amorf karbona tercih edilen bir destek yapısı olarak kullanılmıştır22. Daha yakın zamanda, mekanik stabilitesi, yüksek iletkenliği, arka plan gürültüsüne son derece düşük katkısı23 nedeniyle grafen’in TEM destek filmi olarak kullanılmasına ve makroskopik olarak geniş monolayer grafen24 alanlarının üretilmesi ve TEM ızgaralarına aktarılması için tekrarlanabilir yöntemlerin ortaya çıkması nedeniyle yeniden canlanan bir ilgi olmuştur25 . Grafen, 11,12,17 destek filminden yoksun buzdan daha benzer veya daha kötü ışın kaynaklı hareketlerden geçen amorf karbonla karşılaştırıldığında, grafen kriyo-EM görüntülerinin ışın kaynaklı hareketinde önemli bir azalma gösterdi12.
Bununla birlikte, hidrofilize grafen, yağ asidi sintazını hava-su arasal denatürasyonundan korurken, bu çalışmanın yazarları, grafenin numune hazırlama sırasında, muhtemelen atmosferik hidrokarbon kontaminasyonunun bir kombinasyonu ve şebekeleri hidrophilize etmek için kullanılan reaktiften dolayı kirlendiğini belirtmektedir10. Gerçekten de, grafen’in üstün niteliklerinin çoğuna rağmen, yaygın kullanımı, sonuçta kimyasal olarak zor olan ve uzman ekipman gerektiren hidrofobikliğini azaltmak için gereken türetme tarafından hala engellenmiştir. Bu makalede, destek filmlerini oluşturuldukları yüzeylerden TEM ızgaralarına doğrudan aktarmak için üç boyutlu (3D) baskılı numune yüzdürme bloğu27 kullanılarak amorf karbon, grafen oksit ve grafen numune desteklerinin hazırlanmasına yönelik protokoller rapor edilmektedir (Şekil 1). Böyle bir cihazı kullanmanın önemli bir avantajı, filmlerin ıslatılması, desteklerin hidrofobik kirlenmesini en aza indirmesi ve dolayısıyla daha fazla tedaviye ihtiyaç duyması ve potansiyel olarak zarar verici manuel elleçleme adımlarının sayısını azaltmasıdır. Bu yaklaşımlar uygulanması ucuzdur ve bu nedenle örnek desteklerin gerekli olduğu kriyo-EM çalışmaları için yaygın olarak erişilebilir ve uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, kriyo-EM numune hazırlama için hem amorf karbon hem de grafen filmlerin örnek bir floatation blok27 kullanılarak işlenmesi için protokoller sunulmaktadır. Destek bloğu için bir STL dosyası, herkese açık Thingiverse deposundan [www.thingiverse.com/thing:3440684] serbestçe kullanılabilir ve uygun bir reçineden uygun stereolitografi yazıcısıyla 3D olarak basılabilir. BIR TEM ızgarasını kaplayan karbon filmlerin kullanımı genellikle numunenin üzerine karbon yüzdürülmeyi içerir28. Negatif leke ızgaraları hazırlamaya yönelik bu yaklaşım, destek elleçleme sırasında hava maruziyetini en aza indirir, böylece kontaminasyonu ve protein denatürasyonunu azaltır. Küçük kuyularda yüzen karbon kullanılarak ızgaraların hazırlanması, daha büyük bir yüzey alanında, yani bir su banyosunda veya Petri kabında yüzmek için avantajlıdır, bu durumda karbonun mekanik olarak kesilmesi çok daha kolay gerçekleşir.
Yayın anında mevcut sağlık ve güvenlik düzenlemeleri nedeniyle UAc satın almak zor olabilir. Yaygın olarak kullanılan, radyoaktif olmayan, negatif boyama reaktifleri mevcuttur ve hazırlıkları için protokoller daha önce tanımlanmıştır29. Bu destek yüzdürme bloğu ile alternatif lekeler kullanılmamış olsa da, inkübasyon süresinin zaten doğal olarak numuneye bağımlı olan örnekle (adım 3.5) optimizasyonu dışında bu protokollerde herhangi bir farklılık olması muhtemel değildir. Bu GrOx destek hazırlama protokolündeki temel adım, su ve GrOx çözümünün ızgara kenarı etrafında temas etmesini önlemek için notla vurgulanan 4.4 adımıdır. Su ve GrOx çözeltilerinin uygunsuz bir şekilde karıştırılması, Kılcal etki ile GrOx pullarının tek yönlü olarak yerleşmesini önler. Karbon folyonun her iki tarafında GrOx pullarına sahip olmak kalın katmanlarla sonuçlanır, böylece GrOx’u neredeyse tek katmanlı bir destek olarak kullanmanın avantajlarını olumsuzlar ve ayrıca pullar arasında su hapsederek ek buz katmanlarıyla kullanım alanlarının kirlenmesine neden olur. Grafen oksit destek hazırlığı, esnek poliolefin film üzerinde çözelti damlacıkları kullanılarak elde etmek nispeten kolaydır. Bununla birlikte, bu şekilde gerçekleştirildiğinde, hataları yanlış kullanarak ızgaranın bakır tarafını yanlışlıkla kirletmek daha kolaydır; floatation bloğunun kullanımı bu olasılığın olasılığını azaltır.
Son olarak, bu makale, hidrofilik hale getirmek için her türlü grafen ön işlemden kaçınan grafen kaplı ızgaralar hazırlamak için bir protokol sunar, böylece maliyetini azaltır ve erişilebilirliğini artırır. Numune hazırlama boyunca ıslanmış bir filmin bakımı ve numunenin donmadan hemen önce blokta yerinde uygulanması, homojen bir numune dağılımı ile kriyo-EM için uygun buz katmanlarının üretilmesine izin vermek için yeterlidir. Genel olarak, burada sunulan protokoller hava-su arayüzü ile numune temasını en aza indirir, bu nedenle numune denatürasyonunu azaltır ve kontaminasyonu destekler. Bu yaklaşımlarda kullanılan üç destek filmi için, sağlam, iyi korunmuş tek parçacıkların görüntülenmesiyle birlikte ızgaralar boyunca homojen numune dağılımları elde edilebilir.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu tekniklerin testine yardımcı olan Imperial College London Yapısal ve Sentetik Biyoloji Bölümü’nün tüm üyelerine, Imperial College Advanced Hackspace’teki Harry Barnett’e ve Yapısal Biyoloji Merkezi’nden Paul Simpson’a teşekkür ediyor. CHSA, Wellcome Trust ve Royal Society (206212/Z/17/Z) tarafından ortaklaşa finanse edilen sir Henry Dale Bursu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
| Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
| Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
| Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
| Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
| Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
| Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
| n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
| Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
| Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
| Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
| Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |
参考文献
- Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and “Visual Proteomics”. Proteomics. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), 35-41 (2016).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
- D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461 (2013).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
- Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183 (2003).
- Hummers, W. S., Offeman, R. E. Preparation of Graphitic Oxide. Journal of the American Chemical Society. 80 (6), 1339 (1958).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
- Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. 生化学. 7 (6), 2143-2152 (1968).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
