使用支撑浮块在透射电子显微镜中制备样品支撑膜

1. TEM格栅预支撑转移的一般准备 使用一对干净、细的镊子，将TEM网格依次提升并浸入双蒸馏水（ddH2O）或超纯水中10-15秒，然后用乙酸乙酯浸泡10-15秒。注意：这里使用了负作用，斜尖镊子。 将镊子放在一侧，网格仍然握住，风干约5分钟。 等离子清洗网格，以去除表面通过空气或洗涤步骤产生的任何污染物。注意：在这里，等离子体清洁在空气中进行了10-15秒，射频功率为25 W。 2. 试剂溶液的一般制备 乙酸铀酰（UAc）溶液（2%w / v） 将 50 mL 试管包裹在铝箔中，加入 50 mL 超纯水，加入 1 克 UAc 粉末。注意：UAc 对光敏感，暴露时会随时间而沉淀。由于UAc具有放射性和毒性，因此请保持高水平的清洁度。由于吸入或摄入引起的危害最严重，应格外小心，以防止吸入细颗粒物的可能性。在处理或称量铀盐时，必须始终戴手套。强烈建议使用口罩和护目镜。铀盐必须根据该州内针对放射性危害规定的法律要求进行处置。 将溶液搅拌1小时，以使所有UAc溶解。储存于4°C。 使用前，使用0.22μm过滤器将1mL染色液过滤到小瓶中，以除去任何剩余的醋酸盐晶体。 氧化石墨烯（GrOx）悬浮液 将2.5μLGrOx移入1.5mL管中（1%终浓度）。将2.5μL10%（w / v） 正十二烷基β-D-麦芽糖苷（DDM）洗涤剂移入GrOx中，并轻轻混合（0.1%（w / v）最终浓度）。 向GrOx-DDM混合物中加入245μL超纯水，并立即剧烈涡旋5分钟，在制备后1小时内使用GrOx悬浮液，在立即使用前剧烈涡旋至少1分钟。 氯化铁（III）溶液（FeCl3）溶液（10%w / v） 在称重艇中小心称量 5 克 FeCl3 。转移到含有 35 mL ddH2O 和磁搅拌棒的 100 mL 测量池中。 置于磁力搅拌板上，溶解FeCl3，加入ddH 2 O至最终体积50 mL。通过0.8μm注射器过滤器过滤FeCl3 溶液到干净的瓶子中进行储存。注意：FeCl3 具有腐蚀性和刺激性;在进食、饮用或吸烟前以及下班时，用温和的肥皂和水洗手和其他暴露部位。在加工区域提供良好的通风，以防止形成蒸汽。不要吸入雾气，蒸气，喷雾。处理或称量盐时必须始终佩戴手套。强烈建议在使用时佩戴口罩和护目镜。 3. 云母上碳载体膜的缓冲液交换，以使用载体浮选块制备负染色样品 清洗和等离子清洗透射电镜栅格。注：此处使用了300目多孔碳铜网格，如上文第1节所述。 将10-12μL样品移液到浮选块的缓冲液交换孔（具有小通道）和10-12μL2%UAc溶液（见第2.1节）中，用于将负染色到相邻的非缓冲液交换孔中。注：孔的体积为10μL;但是，调整样品体积，以便在液体表面形成凸面半月板，以允许适当的薄膜漂浮。样品量少可能会导致薄膜破损。 小心地切下两小块云母，上面有预先沉积的碳膜。确保云母碎片足够宽以适合孔（3.4毫米宽）并且比孔长度（3.45毫米）长，以便碎片在碳漂浮时位于井上，并且有足够的空间用镊子处理碎片。注意：要处理碳，请使用扁平负作用长头镊子。切割云母碎片时，使用单个动作进行切割，以保持碳膜的完整性。 将云母以近似45°的角度浸入孔中，直到云母位于孔的斜坡上，并在液体样品的表面观察到一层碳。 在样品上初始孵育后（通常为20秒至20分钟，具体取决于样品粘附性;根据实验需要优化此时间段），非常缓慢地取出云母片以回收碳膜并最大限度地减少残留的粘性样品保留。 通过用滤纸敲击下表面（非碳侧）以除去多余的液体来小心地吸印云母，然后通过施加到含有2%UAc溶液的相对孔（即，像步骤3.4中那样浸没云母）将带有样品的碳交换成负染色剂。注意：此时应观察到碳层漂浮在污渍溶液的顶部。 回收漂浮的碳层，方法是使用经过清洗和等离子体清洁的EM网格的多孔碳覆盖的一侧。将网格风干，直到在TEM上成像。理想情况下，在干燥过程中覆盖网格以避免空气污染。 4. 支撑浮选块在制备氧化石墨烯涂层透射电镜网格中的应用 如上所述，使用300目多孔碳铜网格进行清洗和等离子清洗的TEM网格（第1节）。 将10-12μLGrOx悬浮液（见第2.2节）移液到沿浮选块的4个非缓冲液交换孔中。将10-12μL ddH 2 O或超纯水移入块的其余4个缓冲液交换孔中。注意：该体积的水应足以形成略凸的半月板，高于块的高度。 将4个网格轻轻地滴到每个孔的GrOx悬浮液上1分钟，确保多孔碳覆盖的一侧与溶液接触。1分钟后，通过将镊子滑入每个非缓冲交换孔的镊子槽中，仔细恢复每个网格。 非常轻柔和地将每个网格的铜，非碳覆盖的一侧触摸到相邻孔中的ddH2O。然后，小心而轻柔地将网格，水滴面朝下，靠在一张滤纸上。注意：吸走水将通过毛细管作用将GrOx悬浮液通过网格。避免将电网淹没在ddH2O中至关重要，因此接触应该非常简短。当网格被抬起时，一滴水应该保持在网格的下面。注意不要移动滤纸上的网格，因为这可能会扰乱GrOx薄片的沉降。 将网格留在镊子中风干，直到用样品制备。理想情况下，在干燥过程中覆盖网格以避免空气污染。 5. 支撑浮选块在单层石墨烯薄膜上样品制备中的应用 如上所述（第1节）清洗TEM网格，但省略等离子清洗。注意：这里使用了300目多孔碳金网格，但其他非铜网格或铜合金网格也是可行的。 要用石墨烯沉积网格，请直接从生长在铜（Cu-石墨烯）衬底上的石墨烯转移到冷冻电镜网格中，如前所述25。 将四个洗涤的网格放在沉积在载玻片上的Cu-石墨烯片（10 mm×10 mm）的顶部，并用一滴异丙醇（5-10μL）覆盖每个网格，以允许单层石墨烯和网格之间紧密接触。注意：确保将网格的多孔碳覆盖侧与石墨烯片接触。 当异丙醇完全蒸发（通常为2小时）时，将带有网格的Cu-石墨烯片漂浮到玻璃培养皿中的10%（w / v）FeCl3 溶液（见第2.3节）上，并在室温下蚀刻过夜。盖上培养皿以避免空气污染。注意：蚀刻完成后，只有石墨烯单层将保持漂浮在FeCl3 溶液上 – 这应该在合适的照明下用眼睛可见。 使用直径大于TEM网格尺寸的环路将漂浮在石墨烯单层上的网格钓鱼，并小心地转移到含有ddH2 O的玻璃培养皿中进行洗涤。注意：钓鱼网格时要非常小心，以免撞到培养皿的墙壁，这可能会导致石墨烯薄膜断裂或弯曲。 通过钓鱼网在水中再洗涤两次，然后转移到含有ddH 2 O的干净培养皿中，以除去所有残留的FeCl3。最后，将网格转移到含有样品缓冲液的培养皿中，直到样品制备和骤冻。注意：网格的石墨烯覆盖的一侧必须始终保持湿润，以避免暴露于空气污染物中。 将样品（10-12μL）移液到浮选块的非缓冲液交换孔中。当样品在块中准备就绪时，使用一对干净的镊子从缓冲溶液中取出石墨烯涂层的网格，然后放置在含样品孔的表面上。 经过适当的孵育期（1-5分钟，取决于样品;根据实验需要进行优化），用一对干净的冷冻镊子选择网格，然后继续进行转印和玻璃化。