급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사

참고 : 모든 실험은 연구에서 동물의 보살핌과 사용에 대한 제도적 지침을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 이 프로토콜은 슬로베니아 공화국 식품 안전, 수의학 부문 및 식물 보호를위한 행정부의 승인을 받았습니다 (허가 번호 : 34401-35-2018 / 2). 1. 췌장조직조각의 제조 참고: CLSM을 이용한 칼슘 이미징을 위한 급성 마우스 췌장 조직 슬라이스의 제조는 여러 가지 도구, 다양한 용액이 필요하며 그림 1 에 개략적으로 제시되고 아래에 자세히 설명된 일련의 중요한 단계로 진행됩니다. 그림 1: 워크플로 다이어그램 췌장 조직 슬라이스 준비 과정에서 모든 단계의 개략적인 표현은 일반적인 담관에 아가로오스를 주사하는 것으로 시작하여 췌장의 추출과 슬라이싱이 뒤 따른다. 준비된 조각은 Live/Dead 키트로 조직의 생존력을 평가하거나 칼슘 센서로 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 일단 얼룩이 묻으면 이미징 할 준비가됩니다. 이미징 과정에서 얻은 기록은 데이터 분석에 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 용액의 제조참고 : 모든 용액은 미리 준비해야하며 최대 한 달 동안 4-8 ° C의 냉장고에 보관할 수 있습니다. 조직 슬라이스의 제조 및 저장을 위해, 6 mM 글루코스와 0.3 L의 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충액이 있는 약 0.5 L의 세포외 용액(ECS)이 필요하다. 1-2 mL/min 유량으로 설정된 주변 융합 시스템을 사용한 칼슘 이미징을 1일 동안 약 0.5L의 ECS가 필요합니다. 6 mM 글루코스를 갖는 세포외 용액 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 6 mM 글루코스, 6 mM 젖산,3 mM 미오이노시톨, 2.5 mM KCl, 2 mM Na 피루베이트, 2 mM CaCl2,1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 및 0.5 mM 아스코르브산을 함유하는 ECS 1 L를 제조하였다. 모든 재료가 완전히 녹을 때까지 철저히 혼합하십시오. 50 μL의 ECS를 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 제조업체의 지침에 따라 삼투압계 위에 놓고 삼투압을 확인합니다.참고: 삼투압은 300-320mOsm이어야 합니다. 베타 세포의 자극을 위해, 더 높은 포도당 농도를 가진 해결책을 사용하십시오. 슬라이싱 및 실험 동안 7.4의 생리학적 pH 값을 보장하기 위해, 기압에서 ECS를 카르보겐(즉, 95%O2 및 5%CO2의 가스 혼합물)으로 지속적으로 버블링한다. 간단한 버블링 시스템은 5mm 실리콘 튜브의 한쪽 끝을 카르보겐 공급원(즉, 가압 가스 실린더)에 부착하고 튜브의 다른 쪽 끝을 ECS를 포함하는 병에 직접 배치하여 설정할 수 있습니다. 대안적으로, 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO3,30 mM 미오이노시톨, 25 mM KCl, 20 mM Na 피루베이트, 12.5 mM NaH2PO4, 및 5 mM 아스코르브산을 함유하는10x 스톡을 제조하였다. 6 mM 글루코스를 함유하는 ECS가 필요할 때, 스톡 100 mL를 2 mL의 1 MCaCl2, 1 mL의 1 MMgCl2, 0.455 mL의 13.2 M 젖산, 및 1.08 g의 글루코스와 혼합하고, 1 L까지의 이중 증류수로 채운다. 필요한 경우 다른 양의 포도당을 사용하여 다른 포도당 농도를 얻으십시오. 6 mM 글루코스를 갖는 HEPES 완충액 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM 글루코스, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2를 함유하는 0.5 L HEPES 완충 용액 (HBS)을 제조하고; 1 M NaOH로 pH = 7.4로 적정한다.참고: 카르보겐을 사용할 수 없는 경우 ECS 대신 모든 단계에 이 버퍼를 사용할 수 있습니다. 아가로스 (1.9% 승/w) 수조를 40°C로 예열한다. 0.475g의 저융점 아가로스 및 6mM 글루코스를 함유하는 ECS 25 mL를 삼각 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 끓기 시작할 때까지 몇 초 동안 최대 전력으로 전자레인지에 넣는다. 플라스크를 오븐에서 꺼내어 아가로스가 완전히 녹을 때까지 몇 번 소용돌이치십시오. 액체 아가로오스와 함께 플라스크를 40°C에서 예열된 수조로 옮기어 아가로스를 원하는 온도로 냉각시키고 주입될 때까지 액체를 유지한다. 안정화 리드 링으로 플라스크를 고정하십시오.참고 : 아가로스는 미리 준비하고 냉장고에 보관할 수 있습니다. 사용 전에, 아가로스를 액화될 때까지 전자레인지에서 따뜻하게 하고, 삼각플라스크를 40°C로 예열된 수조로 옮긴다. 아가로스는 최대 5x까지 재사용 할 수 있습니다. 5x 이상으로 재사용하면 밀도가 높아지고 주입하기가 더 어려워집니다. 아가로스와 췌장 주사참고: 섹션 1.2 및 1.3에서는 칼슘 이미징, 전기생리학, 면역조직화학, 분비 연구 및 구조적/미세해부학적 연구와 같은 다양한 실험 목적으로 사용할 수 있는 조직 조각의 제조에 대해 설명합니다.5 mL 주사기를 단계 1.1.3.2로부터의 수조에서 삼각 플라스크로부터의 액체 아가로오스로 채우고, 임의의 기포를 제거하고, 30 G 바늘을 장착한다. 뚜껑으로 바늘을 보호하고 채워진 주사기를 바늘이 아래쪽을 향하게하고 물 표면 아래의 아가로오스의 전체 부피를 수조에 다시 보관하십시오. 링이 수조의 벽에 대해 주사기를 누르는 방식으로 안정화 리드 링으로 주사기를 고정하십시오.참고 : 바늘에 아가로스를 밀어 넣지 않도록주의하십시오.이 바늘은 빠르게 경화되어 바늘을 막습니다. 실내 온도가 낮 으면 경험이 적은 사람이 주사를 수행하는 경우 수조의 온도를 42 °C까지 높여 주사를위한 추가 시간을 확보하십시오. 얼음통에 얼음을 채우고 ECS가 들어있는 병을 넣으십시오. ECS를 기압 및 실온에서 카르보겐으로 1.5mL/min으로 지속적으로 버블링하여 산소화와 7.4의 pH를 보장합니다. 고농도의CO2 를 투여하여 마우스를 희생시키고, 이어서 자궁경부 탈구를 실시한다. 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울이십시오. 입체 현미경으로 작업하면서 개복술을 통해 복부에 접근합니다 (그림 2A). 마우스의 왼쪽으로 장을 부드럽게 뒤집어 (마우스의 해부학 적 관점에서) 일반적인 담관을 노출시킵니다. 포셉을 사용하여 십이지장 부분을 약간 들어 올리고 Vater의 주요 십이지장 유두-유두를 찾으십시오. 지혈제를 사용하여 십이지장 유두에서 일반적인 담관을 클램프 (그림 2B, C)하여 덕트에서 십이지장으로 아가로오스가 누출되는 것을 방지하십시오.참고 : 아가로스 누출이 십이지장으로 누출되는 것을 방지하고 위장관에서 위아래로 더 나아가 지혈제를 두드려 십이지장을 유두에서 근방과 원위 방향으로 고정시킵니다. 이 목적을 위해 곡선 지혈제를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 작은 날카로운 포셉으로 일반적인 담관 아래에 도달하고 덕트를 췌장 조직에 부착하는 막을 부러 뜨립니다. 더 나은 시각적 제어와 쉬운 주사를 위해, 덕트에서 가능한 한 많은 지방과 결합 조직을 제거하십시오. 덕트를 큰 포셉 위에 수직으로 놓고(그림 2D), 준비된 액체 아가로스를 일반적인 담관의 근위 부분에 주입합니다(그림 2D). 아가로스가 점성이 있으므로 주사기를 세게 짜내십시오. 췌장이 희끄무레하고 약간 흐트러질 때까지 또는 적어도 20-30 초 동안 계속 채우십시오.참고: 이 단계는 슬라이스 준비에서 가장 중요한 단계입니다. 췌장의 덕트 나무에 꼬임이 있으면 췌장을 부드럽게 들어 올리거나 주사기에서 당겨 평평하게하십시오. 주사기로부터 주입된 부피에 기초하여 주사를 중단할 시기를 결정하지 않고 십이지장으로의 역류와 십이지장으로의 순방향 누출은 전형적으로 췌장의 덕트 트리에 주입된 부피보다 훨씬 높다. 중요하게도, 성공적인 주사는 주사기 부피의 실질적으로 눈에 띄지 않는 변화로 수행 될 수 있습니다. 주사기를 제거하고, 병으로부터 0-4°C에서 버블링된 빙냉 ECS 20 mL를 췌장 상에 천천히 부어 조직을 냉각시키고 아가로스를 경화시킨다. 포셉과 미세한 터프 컷 가위를 사용하여 췌장을 부드럽게 추출하십시오. 추출한 췌장을 ~40 mL의 얼음처럼 차가운 ECS가 들어있는 100 mm 페트리 접시에 넣고 부드럽게 움직여 씻으십시오. 췌장을 ~ 40mL의 얼음처럼 차가운 ECS가 들어있는 신선한 100mm 페트리 접시에 담으십시오. 희끄무레 한 것처럼 보이는 췌장의 잘 주입 된 부분 (그림 3A)에서 포셉과 거친 절단 가위를 사용하여 0.1-0.2cm3 크기의 조직 6 블록까지 자릅니다. 결합 및 지방 조직을 제거하십시오. 35 mm 끈적임이 없는 바닥-페트리 접시에 40°C에서 약 5 mL의 액체 아가로스 접시를 채우고, 조직 블록을 그 안으로 옮기고, 즉시 페트리 접시를 얼음 위에 올려 놓고 그것을 식히고 아가로스를 경화시킨다.참고 : 췌장 블록이 아가로스에 갇히는 방식은 슬라이스하는 동안 절단되는 방식을 결정합니다. 숙련 된 실험가들은 얼음 위에 놓일 때 아가로스가 굳어지기 몇 분 전에 블록의 위치를 미세 조정할 수 있습니다. 조직 블록을 가진 아가로스가 굳어진 후, 페트리 접시를 거꾸로 뒤집어 100 mm 페트리 접시의 뚜껑과 같은 평평한 매끄러운 표면으로 돌리고, 면도날의 절반으로 부드럽게 절단하여 페트리 접시와 아가로스 사이의 여백으로 아가로스를 제거한다. 면도날로 각각 하나의 조직 블록을 포함하는 개별 아가로스 큐브를 자르고 각 조직 블록이 아가로스로 둘러싸여 있는지 확인하십시오. 시아노아크릴레이트 접착제로 비브라톰의 샘플 플레이트에 아가로스 블록을 붙입니다(그림 3B). 그림 2 : 일반적인 담관에 아가로오스를 주사하십시오. (A) 복강을 열고 복강에 장기를 노출시킵니다. (B) 패널 A의 사각형으로 둘러싸인 영역의 확대된 부분. 십이지장의 흰 점 (화살표로 표시됨)은 Vater의 ampulla를 나타냅니다. 랑게르한의 섬은 화살촉으로 표시되어 있습니다. (C) 곡선 지혈제에 의해 Vater의 ampulla를 고정하고, 그것을 약간 들어 올려 일반적인 담관 (화살표)을 노출시키고 부드럽게 스트레칭합니다. (d) 일반적인 담관의 캐뉼레이션 및 5 mL 주사기 및 30 G 바늘을 사용하여 1.9% 아가로스 용액을 주입한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 깔 끔 히 비브라톰의 절단실을 ~ 0.15L의 얼음처럼 차가운 ECS로 채우고 탄수화물로 끊임없이 거품을 일으 킵니다. 절단실을 얼음으로 감싸고 6 mM 포도당으로 ECS로 만든 2 개의 얼음 조각 (각각 ~ 10 mL)을 절단 챔버에 넣으십시오. 비브라톰에 절단하기 위해 면도날을 장착하고 아가로스 블록으로 샘플 플레이트를 제자리에 나사로 고정하십시오. 슬라이서를 설정하여 0.05 ~ 1 mm/s 및 70 Hz의 아가로스 블록을 표면적이 20-100mm2인 140 μm 두께의 슬라이스로 자릅니다. 슬라이서 설정의 경우 제조업체의 지침을 따르십시오. 각 절단 단계 직후에 슬라이서를 일시 중지하고 미세한 페인트 브러시로 슬라이스를 부드럽게 수집하여 실온에서 6mM 포도당으로 40mL의 HEPES 버퍼로 채워진 100mm 페트리 접시에 옮깁니다(그림 3C).참고: 슬라이스는 실온에서 HEPES 버퍼에 최소 12시간 동안 보관할 수 있으며 버퍼는 2시간마다 교환해야 합니다. 도 3: 췌장 조직 준비 및 슬라이스. (A) 아가로오스 주사 후 추출된 마우스 췌장. 왼쪽의 백색 조직은 잘 주입 된 부분 (십이지장 부분)을 나타내는 반면, 오른쪽의 더 붉은 부분은 췌장의 불충분하게 주입 된 부분 (비장 부분)을 보여줍니다. (B) 아가로스에 매립된 췌장 조직의 두 블록의 비브라톰(Vibratome) 슬라이싱. (C) 화살촉으로 표시된 랑게르한스 섬이 있는 급성 췌장 조직 조각. 스케일 바 = 3000 μm. (D) 랑게르한스의 섬이 화살촉으로 표시된 광현미경 하의 급성 췌장 조직 슬라이스, 별표는 췌장 덕트를 나타낸다. 배율 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 2. 포유류 세포에 대한 LIVE/DEAD 생존력/세포독성 키트를 사용한 라이브/데드 분석 참고: 일부 실험의 경우 다음과 같이 생/사각 분석을 통해 조각에 있는 세포의 생존력을 확인하는 것이 유용합니다(그림 4). 제조업체의 지침에 따라 LIVE/DEAD 생존력/세포독성 키트의 시약으로 바이알을 해동하고 사용 직전에 칼세인 AM의 작업 용액을 준비하십시오. 하루 안에 솔루션을 사용하십시오. 15 mL 원심분리 튜브에서, 5 μL의 4 mM 칼세인 AM (성분 A), 20 μL의 2 mM 에티듐 호모다이머-1 (EthD-1, 성분 B), 및 10 mL의 둘베코 포스페이트 완충 식염수 (D-PBS)를 혼합하여 대략 2 μM 칼세인 AM 및 4 μM EthD-1을 함유하는 작업 용액을 제조하였다. 철저하게 소용돌이. 미세한 페인트 브러시를 사용하여 조직 조각을 신선한 HEPES 버퍼가 있는 3mL 페트리 접시에 부드럽게 옮겨 혈청 에스테라제 활성을 희석합니다. HEPES 버퍼를 제거하고, 슬라이스를 단계 2.2에서 작업 용액의 100-200 μL (또는 필요한 경우 그 이상)로 덮는다. 슬라이스를 닫힌 페트리 접시에서 실온에서 30-45 분 동안 인큐베이션하십시오. 제조업체에서 권장하는 여기 / 방출 필터를 사용하여 조직 조각을 이미지화하십시오. 3. 칼슘 염료 로딩 참고 : 형광 염료는 염료의 준비 및 로딩의 전체 과정뿐만 아니라 염색 된 조직 조각을 취급하는 동안 빛 노출로부터 보호되어야합니다. 주석 호일은 칼슘 염료가 들어있는 튜브 또는 페트리 접시를 덮는 데 사용할 수 있습니다. 염료 준비 세포 투과성 Ca2+ 지시약 염료 (여기/방출 495/523 nm; 물표 참조), 7.5 μL의 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 2.5 μL의 폴락사머(DMSO 중의 20% 용액; 물자 표) 6.667 mL의 HBS에서 6 mM 글루코스를 함유하는 15 mL 스크류 캡 튜브.참고: 이 최종 용액은 6μM의Ca2+ 인디케이터 염료, 0.11% DMSO 및 0.037% 폴락사머를 함유한다. 20초 동안 피펫으로 스크류 캡 튜브 내의 용액을 반복적으로 흡인하고 배출하는 단계; 튜브를 초음파 욕조 챔버에 30 초 동안 잠그고 30 초 동안 와류하여 가용화를 향상시킵니다. 단계 3.1.1에서 제조된 최종Ca2+ 지시약 염료 용액 3.333 mL를 분취량 5 mL 페트리 디쉬에 넣는다. 염료 로딩 HBS가 있는 60 mL 페트리 접시에서 준비된 조직 조각을 얇고 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 각 조직 조각을 부드럽게 들어 올려 염료 용액으로 채워진 5 mL 페트리 접시에 넣고 염료 용액에 넣습니다. 페트리 접시 당 최대 10 개의 조직 조각을 배양하십시오. 슬라이스가 장착된 페트리 접시를 분당 40턴으로 50분 동안 궤도 운동으로 설정된 실온에서 궤도 셰이커에 놓습니다. 실온에서 주위 공기에 노출된 염료 용액 내의 슬라이스를 인큐베이션하되, 페트리 접시를 주석 호일로 덮음으로써 빛으로부터 보호한다. 슬라이스 저장 염색된 조직 조각을 5 mL 페트리 접시에서 염료가 없는 HBS로 채워진 60 mL 페트리 접시에 옮기고, 미세하고 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 부드럽게 들어 올린다. 페트리 접시 당 최대 20 조각까지 보관하십시오.참고: 이 시점에서 이미징을 위해 조직 조각을 사용하십시오. 조직 절편은 몇 시간 동안Ca2+ 지시자 염료를 보유할 것이다. 조각의 생존과 염료의 보유는 얼음으로 둘러싸인 격리 된 용기에 Petri 접시를 놓음으로써 개선 될 수 있습니다. 이것은 염료가 로딩된 슬라이스가 수송되어야 하는 경우에 특히 중요하다. 또한 2시간마다 HBS를 교환하십시오. 4. 칼슘 이미징 공초점 현미경의 설정 연구의 관심에 따라 적절한 목표 배율을 선택하십시오. 20x 및 25x(숫자 조리개 [NA] 0.77-1.00)를 선택하여 전체 섬, 여러 acini 동시에 또는 더 큰 덕트를 시각화합니다. 세포 내 역학을 연구하기 위해 더 높은 배율을 선택하십시오. 타임랩스 이미징을 위한 획득 모드(예: 타임랩스, xyt 또는 이와 유사한 모드)를 선택합니다. 핀홀을 100-200 μm로 설정하십시오. 녹색 형광단의 광 경로를 설정하십시오 : 488nm에서 여기, 500-700nm에서 방출 수집. 바람직하게는 광배수 검출기보다 높은 양자 효율(예를 들어, 갈륨 비소 포스피데)을 갖는 검출기를 선택한다. 기록 챔버 및 주변 시스템의 설치 기록 챔버를 현미경 및 주변 융합 시스템의 온도 제어 스테이지에 장착합니다(중력 공급 또는 연동 펌프 기반 설정, 부피 1mL). 챔버 내의 향수가 구불구불 액체 반월 연골 높이와 perifusate의 물방울이 표류하지 않도록하십시오. 주변 융합 시스템의 온도 제어를 37°C로 설정합니다.비자극 용액으로 주위융합을 시작하고 자극 용액을 준비합니다. 전동 밸브를 통해 또는 주변 시스템을 공급하는 솔루션을 수동으로 전환하여 솔루션을 변경하십시오. 칼슘 역학 기록 단일 조직 조각을 기록 챔버로 옮깁니다. 조직 조각을 U자형 백금 중량으로 타우트 나일론 메쉬(예: 나일론 스타킹으로부터)로 고정시킵니다. 나일론 스레드를 관심있는 구조 위에 배치하지 마십시오. brightfield 옵션을 사용하여 섬/acinus/덕트를 찾습니다. 라이브 이미징을 실행하여 연구된 구조물을 시야에 배치하고 이미징 파라미터를 설정합니다. 레이저 전력, 검출기 증폭 및 라인 평균화/비닝을 조정하여 신호 대 잡음비를 최적화하여 레이저 전력을 최소한으로 유지하면서 셀을 시각화할 수 있습니다. 절단면에서 잠재적으로 손상된 셀로부터 기록되지 않도록 기록의 초점면을 절단면 아래 ~15μm로 조정하십시오(그림 5). 이미지를 획득합니다. 샘플링 주파수를 1-2Hz로 설정하여 초기에 개별 진동을 감지하고, 더 높은 획득 속도(>10Hz)에서 빠른 회선 평균화(8-20)가 가능한 공진 스캐너를 사용하여 세포 내 Ca2+([Ca2+]IC) 활동을 기록합니다. 광독성을 방지하기 위해 연속적인 점 조명 사이의 간격(예를 들어, 전체 샘플링 시간의 30%)을 허용한다. 시계열 획득 전에 고해상도 이미지(예: 1024 x 1024 픽셀, 선 평균 > 50)를 기록합니다(섹션 5 참조).참고: 1-2Hz의 샘플링 주파수는 대부분의 셀에서 획득 주파수에 대한 나이퀴스트 기준보다 낮으며 신호 모양은 기본적으로 언더샘플링됩니다. 이미징 소프트웨어에서 사용 가능한 경우 온라인 차트를 참조하여 준비 응답, 과조명, 광표백 및 기계적 드리프트에 대한 즉각적인 피드백을 얻으십시오. 획득 중 표백 속도가 높은 경우, 기록을 중지하고 레이저 전력을 줄이면서 검출기 이득을 증가시켜 신호 대 잡음비를 유지하십시오. 기계적 드리프트의 경우, 튜브/케이블과 현미경 스테이지 사이의 장력과 액체 누출 또는 기록 챔버의 볼륨 변화를 확인하십시오. 선택적으로, 수동으로 획득하는 동안 드리프트를 수정하려고 시도; 그러나 이것은 본질적으로 제한된 결과를 산출한다는 점에 유의하십시오.참고: 내분비 세포는 역치에 가까운 농도에서 매우 이질적입니다. 개별 세포에서 활성화/비활성화 지연의 범위를 검출하기 위해서는 충분한 자극 길이가 필요하다. 이는 매우 자극적인 프로토콜에 따른 오프 응답의 정확한 검출을 위해 특히 중요하다. 칼슘 이미징을 사용하여 endo- 및 외분비 세포를 기능적으로 구별하십시오 (그림 6). 활성화 및 비활성화 중 일시적인 활동을 기록하려면 기록을 중지하지 않고 자극을 적용하십시오. 실험이 끝난 후 데이터를 저장합니다(자동 저장 기능 사용 고려). 셧다운 절차 중에 레이저가 손상되지 않도록 레이저 전원을 끄기 전에 냉각 기간을 허용하십시오. 5. 데이터 분석 타임랩스 비디오를 재생하여 녹화를 정성적으로 시각적으로 검사합니다. 시야각 또는 광학 평면에서 셀 드리프트를 확인합니다. 광학 평면 내에서 드리프트가 발생한 경우 ImageJ에서 드리프트 보정 플러그인을 사용합니다. 현미경 소프트웨어 또는 타사 소프트웨어를 사용하여 관심 지역(ROI)을 선택합니다. 고해상도 이미지, 최대 투영 또는 프레임 평균을 참조로 사용하여 ROI를 선택합니다. 타임랩스 이미징을 재생하여 참조 이미지에서 볼 수 없는 응답 셀을 시각화합니다. ROI의 선택된 영역이 이웃 셀과 겹치지 않도록 ROI를 배치하여 ROI 간의 신호 누화를 방지합니다. 시계열 데이터를 프레임당 ROI 평균값으로 내보냅니다. ROI 좌표를 내보냅니다. 에 설명된 대로 지수 및 선형 적합도의 조합을 사용하여 표백에 대한 시계열 데이터를 수정합니다(그림 7A).(1)여기서 x(t) 는 시점 t에서의 형광 신호를 나타내고; xcorr(t) 해당 시점에서의 보정된 신호; 및 a, b 및 c 는 corr(t )와 x(t) 사이의 최소 제곱합으로 계산된 적합도의 파라미터이다. 응답의 활성화 및 비활성화 단계를 분석합니다(그림 7B). 시계열 데이터의 첫 번째 미분을 계산하고, 활성화 및 비활성화에 대응하는 유도체의 정점 및 나디르를 각각 결정한다. 또는 phasic 증가의 시작을 수동으로 선택하십시오. 활성화/비활성화 시간과 해당 셀 좌표를 저장하고 내보냅니다. 고원상을 분석한다(도 7C). 원시 데이터를 임계값으로 지정하거나 시계열 데이터의 첫 번째 파생물을 임계값으로 설정하여 개별 진동을 감지합니다. 개별 진동의 시작과 끝을 진동의 절반 진폭에 해당하는 시간으로 정의합니다. 각 셀에 대한 개별 진동의 지속 시간과 빈도를 계산합니다. 인터스파이크 간격의 역값을 계산합니다(일반 활동 패턴에 적합). 또는 진동 수를 레코드의 시간 간격으로 나눕니다(불규칙한 활동 패턴에 적합). 활성 시간을 계산합니다. 활성 시간을 기간의 합계로 표현하고 이 값을 시간 간격으로 나눕니다. 또는 진동에 해당하는 주파수와 지속 시간을 곱합니다.참고: 지속 시간의 합을 시간 간격으로 나누면 강력한 결과를 얻을 수 있지만 셀당 단일 데이터 요소가 얻어질 때 통계적 차별이 낮습니다. 발진의 주파수와 지속 시간을 곱하면 발진 대 발진 시간 분해능이 제공됩니다.