Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

Acetyl-CoA is de fundamentele bouwsteen van diverse biomoleculen, waaronder neutrale lipiden (NLs), die dienen als een veelzijdige biomoleculaire valuta voor het bouwen van membranen, het genereren van ATP en het reguleren van celsignalering^1,2. De beschikbaarheid van NLs die in een van deze respectieve trajecten moeten worden gemeden, wordt gedeeltelijk gereguleerd door hun opslag. Lipidedruppels (LDs), cytoplasmatische organellen bestaande uit hydrofobe kernen van triglyceriden (TGs) en sterolesters (SE’s), zijn de belangrijkste opslagcompartimenten van de meeste cellulaire NLs. Als zodanig, LDs sequester en reguleren NLs, die kunnen worden afgebroken en vervolgens worden gebruikt voor biochemische en metabolische processen^3,4. Het is bekend dat de verkeerde regulatie van NL- en LD-geassocieerde eiwitten gecorreleerd is met het begin van pathologieën waaronder lipodystrofie en metabool syndromen^5,6. Hierdoor is het huidige LD-onderzoek intensief gericht op hoe NL-synthese ruimtelijk, tijdelijk en over verschillende weefsels van multicellulaire organismen wordt gereguleerd. Vanwege de alomtegenwoordige cellulaire rollen voor NLs, worden veel enzymen die verantwoordelijk zijn voor de synthese en regulering van NLs bewaard in eukaryoten⁷. Inderdaad, zelfs sommige prokaryoten slaan NLs op in LDs⁸. Daarom zijn genetisch trekbare modelorganismen zoals Saccharomyces cerevisiae (ontluikende gist) nuttig geweest voor de studie van NL-synthese en -regulatie.

De scheiding en kwantificering van NLs uit celextracten kan op talloze manieren worden bereikt, waaronder gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) en ultra-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (UPLC-MS)^9,10,11. Misschien is de eenvoudigste methode voor het scheiden van NLs via dunnelaagchromatografie (TLC), die latere densitometrische kwantificering mogelijk maakt van een standaardcurve^12,13. Hoewel TLC slechts een koerskorrelige scheiding van NLs biedt, blijft het een krachtige techniek omdat het goedkoop is en het zorgt voor een snelle scheiding van NLs van meerdere monsters tegelijkertijd. Twee van de belangrijkste uitdagingen voor de studie van NLs via TLC zijn: 1) het brede scala aan cellulaire overvloed aan NL-soorten en hun tussenproducten, en 2) het bereik van hydrofielheid/hydrofobiciteit van lipide-tussenproducten binnen NL-syntheseroutes. Bijgevolg is de kwantificering van NL-soorten via TLC doorgaans beperkt tot de meest voorkomende soorten; de introductie van een ¹⁴C-azijnzuur radiolabel kan echter de detectie van tussenproducten met een lage overvloed binnen NL-trajecten aanzienlijk verbeteren. Azijnzuur wordt snel omgezet in acetyl-CoA door de acetyl-CoA synthetase ACS2¹⁴, waardoor ¹⁴C-azijnzuur een geschikt radiolabeling substraat in gist¹⁵. Bovendien kan TLC zowel hydrofobe NLs als hydrofiele tussenproducten van NLs scheiden door het gebruik van meerdere oplosmiddelsystemen¹⁶. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de scheiding van NLs met behulp van ¹⁴C-azijnzuur metabolische etikettering in gist. Lipiden die tijdens de pulsperiode worden geëtiketteerd, worden vervolgens geïsoleerd door een goed vastgesteld totaal lipidenisolatieprotocol¹⁷, gevolgd door de scheiding van NL-soorten door TLC. Het ontwikkelen van TLC-platen door zowel autoradiografie om gelabelde lipiden te visualiseren, als een chemische spray om totale lipiden te visualiseren, maakt meerdere kwantificeringsmethoden mogelijk. Individuele lipidenbanden kunnen ook gemakkelijk uit de TLC-plaat worden gehaald met behulp van een scheermesje en scintillatietelling kan worden gebruikt om de hoeveelheid radioactief gelabeld materiaal in de band te kwantificeren.