金刚石光源的固定目标串行数据收集

1. 准备和加载芯片 注意：该过程发生在湿度受控的环境中（图1），通常在80%至90%或更高的相对湿度之间，以防止蛋白质晶体变干。一旦装载并密封，晶体可以存活超过24小时。然而，这在晶体系统之间可能会有很大差异。在腔室内，需要一个低功率真空泵连接到装载级以容纳硅芯片（图1），硅芯片，带聚酯箔的芯片支架（图2），p200移液器，200μL移液器吸头，镊子，滤纸和蛋白质晶体浆料。 准备一个芯片支架。 将两张聚酯箔切成正方形，约 6 厘米 x 6 厘米。 将聚酯板铺在两个底板（大和小）上。 使用金属密封圈将聚酯板固定到位。 小心地拉动多余的聚酯箔以去除任何折痕，以便以后更容易可视化和定心样品。 选择相对于晶体尺寸具有适当孔径（7-30μm）的硅芯片。 Glow 在 0.39 mBar 下对芯片放电 25 秒，并使用 15 mA 的电流使微晶体在芯片上轻松扩散。 使用镊子将硅芯片放在芯片加载台上，凸起的杆朝下。 使用移液器将200μL微晶浆液涂在芯片的平坦侧。 展开晶体浆料以覆盖芯片的所有”城市街区”。 如果切屑损坏，请用一小块聚酯箔或过滤器移液器吸头覆盖任何孔，以确保可以施加均匀的真空。 轻轻真空，直到所有多余的液体都被吸入芯片。 用镊子从芯片加载级中取出芯片。 用滤纸小心地擦拭芯片的底部，以除去多余的液体。 将装载的切屑放在切屑支架的较大一半上，在导向标记平放的一面朝下之间。 通过将切屑支架的小半部分放在顶部来密封芯片。 芯片支架的两半将卡入到位。如果后半部分没有齐平，请将支架旋转180°以正确对齐磁铁。 用六角螺栓拧紧芯片支架，将芯片牢固地固定到位。注意：或者，可以以类似的方式加载”无屑”芯片，将较小体积的晶体浆料（〜15μL）夹在芯片支架 37中的两层聚酯箔之间，或者可以使用50μm厚的双面粘合剂垫片加载较小体积，直接施加到聚酯箔上，如前所述38.使用粘合垫片还允许在每个无芯片芯片上加载多个样品（或样品的变体，例如配体浸泡）。Diamond39也可以使用利用声波跌落喷射 （ADE） 来装载硅芯片的互补加载方法。与移液器装载相比，ADE允许使用更小体积的晶体浆料装载芯片。当样品稀缺时，这是一种特别有用的技术，但必须考虑浆料的化学成分和粘度。 2. 光束线上的 GUI 和设置 通过简单的 EPICS 显示管理器 （edm） 图形用户界面 （GUI） 执行所有芯片对准和设置，以进行数据收集（图 3a）。这为波束线仪器提供了一个点击式接口，并为基于Python的数据收集提供了输入参数。子窗口为从样品架的子区域收集（图3b）或激光/ LED泵浦探针实验（图3c）提供了额外的控制。 3. 对齐芯片 使用运动学安装座将加载的芯片放在光束线的XYZ级上（如图 4a所示）。 注意避免沿着行进方向拉动载物台。运动学支架中的磁铁非常坚固，因此可以很容易地意外完成。 接近安装座时，应将芯片支架保持在轻微的角度（±30°）。当磁铁接触时，允许芯片支架平行于地板旋转（0°），芯片支架将卡入到位（图4b）。 卸载芯片时，请遵循相反的路径。在将切屑支架拉开之前，旋转芯片并将其倾斜远离载物台。 使用光束线的轴上查看系统和芯片对准 GUI，定位芯片的左上角基准。基准面是三个正方形，两个小和一个大，彼此成直角（图5a）。芯片被背面照亮，因此芯片将呈现黑暗，光圈为白色方块。 以 X、Y 和 Z 中的基准零为中心（图 5b）。通过分别向左/向右和向上/向下移动来对齐 X 和 Y。通过将芯片移入和移出焦点来对齐 Z。 单击”设置基准零”。 对基准1（右上方， 图5c）和基准2（左下， 图5d）重复步骤3.2，以使所有基准与X射线束对齐。 通过按 使坐标系统生成坐标矩阵，该系统计算芯片相对于级的偏移，俯仰，滚动和偏航，从而允许所有后续运动在芯片坐标系中完成。 单击” 块检查 “将 XYZ 阶段移动到每个城市块的第一个井，以直观地确认芯片是否对齐良好。 如果X射线十字准线与光圈对齐，则芯片对齐。如果没有，请重复步骤 3.2-3.3。注意：如果对齐困难（基准面损坏），芯片上的不同光圈可以使用”对齐类型”下拉菜单进行对齐。许多不同类型的芯片可用于固定目标数据收集。通过使用”芯片类型”下拉菜单，可以适应不同的芯片类型。I24最常用的芯片类型是”牛津”和”定制”芯片。芯片上孔径和基准的数字和间距是从 通过 下拉菜单定义的芯片字典中读取的。定制芯片允许动态定义孔径间距，这对于薄膜片对片或其他”无芯片”类型芯片特别有用，其中晶体随机位于支架37上。一个新的Python GUI，提供移动点击功能和自动芯片对齐目前正在开发中，但在撰写本手稿时尚未准备好常规使用。 4. 设置数据收集 注：数据收集设置将取决于所研究的系统以及要执行的实验。这可以从最简单的SSX实验，收集低剂量结构，到使用激光或快速混合来启动反应的时间分辨实验，这将需要在不同的时间延迟下进行多个完整的数据集。要设置数据收集，需要定义以下参数。 实验变量：根据需要填写文件夹、文件名、曝光时间、透射率、探测器距离和每个光圈的拍摄次数。 芯片类型：如上所述，将芯片类型与正在使用的芯片相匹配。 如果正在使用薄膜或”无芯片”芯片，请将芯片类型设置为 无。 在 GUI 中以 x 和 y 定义步数和步长。 设置映射类型：这允许选择芯片的子部分进行数据收集（图3b）。”无”意味着从芯片上的每个孔径收集数据。”Lite”表示从芯片上的选定城市街区收集数据（图3b）。例如，如果已知芯片的某个区域加载不良或为空，这可能很有用。”全”允许选择单个光圈进行数据收集。在这种情况下，必须提供格式正确的文本文件。详细信息和模板可以从光束线工作人员处获得。 泵探头：选择泵探头实验的类型和所需的时间延迟。泵（通常是LED或激光）的触发通常特定于特定的实验，因此此处不会详细描述。 “短”延迟是指当泵和探头之间的每个孔径处都有停留时的实验（即泵，探头，”移动到下一个样品”。延迟通常约为 1 秒或数十毫秒。 长延迟是指兴奋和再次访问（EAVA）策略，其中孔径被访问两次，在访问之间具有定义的时间延迟（即，泵，移动，泵，移动，探头，移动，探头等）。计算时间延迟和X射线曝光时间（图3c），通常约为1秒或更长时间。 5. 常见的数据收集方法 注意：以下是定义所执行实验类型的关键参数。本节假定已定义协议 3″设置数据收集”中的其他设置。 方案 1： 低剂量数据收集。从样品架上的每个选定孔径收集单个衍射图像。 将每个光圈的拍摄张数设置为 1。 将泵探头设置为 无。 方案 2： 剂量序列，从样品架上的每个选定孔径依次收集 n 个图像。芯片在每个光圈处静止，同时收集每组 n个 图像。 将每个光圈的拍摄张数设置为’n’。请注意，如果 n= 5、10、20 或 10 的另一个倍数，则处理将简化。如果 n < 5，则很难建立趋势。考虑覆盖芯片所需的总时间以及 增加n 时产生的图像文件数量是有用的。 将泵探头设置为 无。 方案 3： 泵探针方法 从 泵浦探头 下拉菜单中选择一种方法以打开激光激发控制中心。 对于泵浦探头实验，在每个 孔径选项处填充激光停留 。 对于 EAVA，请在 每个光圈 和 X 射线曝光 处填充激光停留，然后单击 计算。 在 edm GUI 泵探头下拉菜单中选择相应的 “重复 “选项，以获得所需的延迟时间。 如果实验需要预照明步骤，请填充 激光2停留 部分。 定义完所有实验变量后，按 设置参数 并创建短列表。这会将实验变量加载到 geobrick 控制器上。完成此操作后，按 Start 键可将探测器移入，将背光移出，然后开始数据收集。在设置数据收集的所有点上，打开一个终端窗口是很有用的，其中打印了有关每个步骤的状态和结果的反馈。 6. 数据处理 注意：从广义上讲，数据处理可以根据需要反馈的紧迫性分为三组。需要快速反馈来显示晶体是否存在和衍射，如果是，以什么数量。这应该跟上数据收集的步伐。执行数据索引和集成，速度可能较慢，但仍应在与数据收集相当的时间尺度上执行。将反射强度合并和缩放到mtz文件中以进行结构解和电子密度图的生成是最后一步，并且可能更慢。在这里，将仅讨论在I24处启动前两个阶段的管道，因为它们是指导实验的实时反馈所必需的，但请注意，命中率和缩放统计等指标不能代替检查电子密度，这可能提供配体已经结合或发生反应的唯一确认， 在水晶中。 快速反馈 要加载数据处理模块类型 ，请将 i24-ssx 加载 到任何波束线工作站上的终端中。 要在终端中运行命中结果分析类型 i24-ssx /path/to/visit/directory/， 请执行以下操作：i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/注：这将打开三个终端窗口，一旦数据写入磁盘，就会以图形表示来自高级光源衍射集成（DIALS）40，41的点查找结果（图6a）。 默认设置每 10张图像评分 一次，每隔几秒钟刷新一次，以最大程度地减少计算负载。 通过在上面命令的末尾添加一个参数来更改默认值。例如，’i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2′ i24-ssx 将对其他每个图像运行命中查找。但是，这可能会给群集（共享资源！）带来不适当的压力，并减慢处理时间。该图根据成功分度的可能性进行颜色编码，红色表示至少发现了15个布拉格斑点（索引的良好机会），蓝色表示几乎没有有用的衍射。 通过单击点查找器界面上的点，在 DIALS 图像查看器中查看感兴趣的衍射图像。 索引和集成反馈注：衍射数据的分度和积分使用DIALS使用dials.still_process函数40，41进行。因此，与晶体相关的特定信息（预期的晶体空间组、晶胞和实验几何图形）应放入 .phil 文本文件中。 通过键入模块加载终端中的 负载拨号来加载 DIALS 模块。 要开始处理数据集类型，dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil。所有仍在处理的数据集的进度可以通过键入monitor_stills_process.py（在执行模块加载i24-ssx并将目录更改为当前访问后）来运行stills_monitor脚本来监视（图6b）。 索引衍射数据的晶胞分布（图7a）可以使用命令ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true来监测，这对于识别和解析晶胞多晶型特别有用，如前所述42。 ‘Visualzie’如果以及如何通过生成一个2D绘图（图7b），使用 命令python pacman.py/visit/processing/_hit_finding/chip.out来改变这种分布。 使用 DIALS 命令生成所有索引衍射数据的立体投影（图 7c），dials.stereographic_projection hkl= 0，0，1 expand_to_P 1 = True /path/to/dials/output/*refined.expt。注意：当处理来自晶体的静止图像数据时，这是一种常见的病理学，其中Bravais晶格的对称性高于合并数据显示为完美孪生的空间组对称性。数据处理算法已经发展到可以解决这种病理学43，44，45，46，但用户在处理他们的数据时应该注意这一点。