Surveillance de l’activité de l’élastase neutrophile et de la cathepsine G dans les échantillons d’expectorations humaines

Les protocoles suivants décrivent l’analyse effectuée sur les expectorations humaines. Le traitement des échantillons humains a été approuvé par le comité d’éthique de l’Université de Heidelberg et le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients ou de leurs parents/tuteurs légaux (S-370/2011) et des témoins sains (S-046/2009). REMARQUE: Les protocoles suivants décrivent la préparation de l’échantillon et la quantification de l’activité des protéases de sérine neutrophile (PSN). Les procédures expérimentales présentées ici se concentrent sur les expectorations humaines et la mesure de l’activité de l’élastase14,20,21 (Ne) ou de la cathepsine G15 (CG). Cependant, de légères adaptations dans le protocole de préparation de l’échantillon rendent possible l’analyse des cellules dérivées du sang et des homogénats tumoraux. De plus, les activités de la métalloprotéinase matricielle 12 et de la cathepsine S peuvent être étudiées de manière similaire au moyen de sondes FRET dédiées22,23,24,25,26. 1. Préparation de l’échantillon: isolement cellulaire et séparation des surnageants NOTA : Si possible, le traitement des expectorations doit être effectué dans les 120 minutes suivant l’expectoration et les expectorations doivent être conservées sur de la glace jusqu’à un traitement ultérieur. Si l’expectoration spontanée des expectorations n’est pas possible, induire des expectorations comme décrit précédemment19. En bref, inhalez 200 μg du salbutamol antagoniste des récepteurs β-2 avant de commencer la procédure d’induction des expectorations. Ensuite, inhalez une solution saline hypertonique (6%) pendant 15 min à l’aide d’un nébuliseur. Recueillir les expectorations expectorées dans une boîte de Pétri. Séparez les touffes de mucus de la salive dans une boîte de Pétri à l’aide d’une pointe de pipette. Peser le mucus.REMARQUE: Le poids moyen d’un échantillon de mucus est de 0,8 g (variant entre 0,1 g et 5 g); 0,1 g sont généralement suffisants pour effectuer les procédures mentionnées. Ajouter 4 parties (v/p) de 10 % de sputolysine (en PBS) aux expectorations (par exemple : 4 mL de sputolysine à 10 % pour chaque gramme d’expectorations).ATTENTION : La sputolysine est composée de dithiothreitol concentré dans un tampon phosphate, donc manipulez-le avec soin. Incuber le mélange à température ambiante (RT) sur un agitateur à bascule pendant 15 min pour dissoudre le mucus. Pour des raisons de sécurité, placez le shaker dans une hotte. Éteindre la réaction en ajoutant le même volume de PBS froid (par exemple: 1 mL de PBS froid pour chaque mL de 10% de Sputolysine). Mélanger par pipetage pour obtenir une solution homogène. Filtrer le mélange à travers une passoire à cellules en nylon de 100 μm dans un tube de 50 mL. Répétez l’étape de filtration à travers une passoire à cellules en nylon de 40 μm. Centrifuger la solution pendant 10 min à 300 x g à 4 °C. Transférez soigneusement la fraction surnageante dans un tube frais et conservez-la sur de la glace.REMARQUE: Les fractions surnageantes peuvent être stockées à -20 °C ou -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie. Remettre doucement la pastille cellulaire dans 500 μL de PBS froid et la placer sur de la glace.Remarque : la fraction de cellule doit être traitée immédiatement. 2. Mesure de l’activité de la sérine protéase neutrophile NOTE: Ici, différentes méthodes sont introduites pour quantifier l’activité des PSN au moyen de déclarants fret. Le choix de la technologie est dicté par la question biomédicale spécifique et le but de l’expérience. Les sondes présentées ont été largement testées pour leur spécificité par rapport à un ensemble d’enzymes pulmonaires pertinentes14,15. Bien que les sondes soient spécifiques à leur enzyme cible, vérifiez toujours la spécificité de la sonde sur l’échantillon clinique d’intérêt. Ceci peut être réalisé en incubant l’échantillon avec un inhibiteur spécifique de protéase avant l’addition de sonde, qui devrait abolir toute augmentation du rapport D/A. Quantification de l’activité des PSN solubles par fluorimètre ou essai de lecteur de plaqueREMARQUE: L’activité de la protéase dans les fractions solubles de l’échantillon peut être détectée avec n’importe quel instrument capable de détecter la fluorescence.Dégeler les enzymes sur la glace. Jusqu’à l’utilisation, conserver ne et cg dans le tampon de stockage acide (acétate de sodium 50 mM, NaCl 200 mM, pH 5,5) pour éviter l’auto-clivage. Pour établir une courbe standard enzymatique, préparer une dilution en série de 1:2 de l’enzyme (33,9 – 0,271 nM pour NE; 42,6 – 0,333 nM pour CG) dans le tampon d’activation (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl à pH 7,5). Le tampon d’activation a un pH neutre et permet donc à la catalyse enzymatique de se produire efficacement. Pour préparer la concentration standard la plus élevée (concentration en NE : 33,9 nM), diluer 1 μL de NE (33,9 μM) dans 999 μL de tampon d’activation. Pour préparer le deuxième étalon (concentration en NE : 16,95 nM), mélanger 200 μL de la première dilution avec 200 μL de tampon d’activation. Procédez en conséquence pour préparer les dilutions 1:2 restantes. La dernière norme, qui est le blanc, est composée d’un tampon d’activation pur. La mesure des doublons techniques ou des triples est recommandée. Pendant la préparation de l’étalon et de l’échantillon, essayez de garder les flacons sur la glace. Parallèlement à la préparation standard, diluer les échantillons d’expectorations dans un tampon d’activation. Diluer les échantillons humains avant d’évaluer leur activité protéase pour rester dans la plage linéaire d’augmentation du signal rapporteur (rapport donneur/accepteur). Si les échantillons de patients n’étaient pas dilués, le clivage se produirait trop rapidement pour un raccord fiable. Étant donné que les expectorations de donneurs sains contiennent moins de protéases actives que les échantillons provenant de patients atteints de mucoviscidose et de MPOC, différentes dilutions sont généralement effectuées (1:10 pour les expectorations saines surnageantes, 1:20-500 pour les expectorations surnageantes des patients atteints de MPOC ou de mucoviscidose).NOTA : Afin de mesurer quantitativement l’activité de la protéase dans des échantillons où leur concentration est inconnue, une courbe standard avec des concentrations enzymatiques connues doit être mesurée en parallèle, idéalement sur la même plaque. La concentration d’enzymes actives dans les expectorations humaines est calculée en interpolant les pentes mesurées dans les échantillons d’expectorations humaines avec celles mesurées avec les courbes standard. Avant de préparer les échantillons pour la mesure, configurez l’instrument. Réglez la longueur d’onde d’excitation de la sonde NE FRET (NEmo-114)sur 354 nm et réglez la longueur d’onde de détection sur 400 nm pour le donneur et 490 nm pour l’accepteur. Réglez la longueur d’onde d’excitation de la sonde CG FRET (sSAM15)sur 405 nm et réglez l’émission sur 485 (donneur) et 580 nm (accepteur). Ajouter 40 μL d’échantillons, standard ou vierge, dans les puits d’une plaque noire de 96 puits demi-surface. Pour préparer le mélange maître contenant les rapporteurs (concentration du rapporteur dans le mélange maître : 10 μM), diluer le stock de sonde (1 mM en DMSO) 1:100 dans le tampon d’activation. Préparer le volume de mélange principal nécessaire en multipliant 10 μL x le nombre de puits de plaque requis. Pour atteindre la concentration finale optimale (2 μM) pour la mesure de la fluorescence des rapporteurs NEmo-1 et sSAM, ajoutez 10 μL du mélange maître à chaque puits (contenant 40 μL d’échantillon, standard ou blanc) et commencez la lecture. Les rapporteurs NEmo-1 et sSAM surveilleront donc l’activité de l’élastase neutrophile soluble et de la cathepsine G, respectivement.Remarque : Si un injecteur de réactif n’est pas disponible, veillez à démarrer la lecture dès que possible après l’ajout de reporter aux échantillons. Démarrez la mesure du lecteur de plaque et enregistrez l’augmentation du rapport donneur / accepteur toutes les 60-90 secondes pendant au moins 20 minutes ou jusqu’à ce que l’augmentation du signal atteigne un plateau. Une fois les données exportées, calculez le rapport donneur/accepteur (rapport D/A) en divisant les unités de fluorescence relative (UFC) du donneur par l’UFC accepteur pour chaque point temporel et échantillon. Calculer la moyenne du rapport D/A et l’écart type de chaque échantillon. Déterminer la pente dans la croissance linéaire du changement de rapport D/A. La pente est un indicateur du taux de clivage enzymatique d’une sonde FRET. Calculer la concentration d’enzymes actives dans les expectorations en ajustant les pentes de régression linéaire dérivées des échantillons humains avec celles calculées à partir de l’étalon enzymatique. Quantification de l’activité des PSN liés à la membrane par fluorimètre ou essai de lecteur de plaque Isoler les expectorations comme décrit ci-dessus. Ressusciter 3 x 104 cellules dans un volume de 40 μL de PBS. Ajoutez bien les cellules au lecteur de plaque. Configurez l’instrument. Réglez la longueur d’onde d’excitation de la sonde NE FRET liée à la membrane (NEmo-214)sur 405 nm et réglez la longueur d’onde de détection sur 485 nm pour le donneur et 580 nm pour l’accepteur. Réglez la longueur d’onde d’excitation de la sonde CG FRET liée à la membrane (mSAM15)sur 405 nm et réglez l’émission sur 485 (donneur) et 580 nm (accepteur). Pour préparer le mélange maître contenant les rapporteurs, diluer le stock de sonde dans le tampon d’activation à une concentration de 10 μM. Préparer le volume de mélange maître nécessaire en multipliant 10 μL X le nombre de puits de plaque requis. Pour atteindre la concentration finale optimale (2 μM) pour la mesure de la fluorescence des rapporteurs NEmo-2 et mSAM, ajoutez 10 μL du mélange maître à chaque puits (contenant 40 μL d’échantillon, étalon ou blanc) et commencez la lecture. Les rapporteurs NEmo-2 et mSAM surveilleront donc l’activité de l’élastase et de la cathepsine G liées à la membrane, respectivement.REMARQUE: Un contrôle négatif cellulaire peut être utilisé, par exemple, des cellules qui ne sécrètent pas activement les PSN. Par exemple, l’incubation des rapporteurs avec 3 x 104 progéniteurs de leucocyte HL-60 cellules promyélocytaires représente un contrôle négatif de clivage valide. Enregistrer le changement dans le rapport donneur/accepteur pendant au moins 20 min ou jusqu’à ce que l’augmentation du signal atteigne un plateau. Analysez les données comme décrit ci-dessus. Mesure de l’activité des PSN liés à la membrane par microscopie à fluorescenceDéterminez le nombre de conditions qui doivent être analysées.NOTA : Pour chaque mesure d’échantillon d’expectorations, il est recommandé de préparer et d’analyser des témoins positifs (PC) et négatifs (NC) supplémentaires. Pour chaque mesure, remise en suspension de 3 x 104 cellules d’expectoration dans un volume de PBS de 50 μL dans un tube de 1,5 mL. Comme témoin négatif, incuber les expectorations avec un inhibiteur spécifique (Siveléstat, inhibiteur spécifique de NE, ou inhibiteur de la cathepsine G I, inhibiteur spécifique de CG, à une concentration finale de 100 μM). Incuber pendant 10 min à TA. Comme témoin positif, incuber des cellules d’expectoration avec l’enzyme appropriée (NE ou CG à 340 nM ou 200 nM, respectivement) pendant 10 min à droite. Ajouter 50 μL de PBS contenant le rapporteur fret et une coloration nucléaire (dans une dilution finale de 1:1000) à chaque tube (cellules traitées par témoin positif, cellules traitées par témoin négatif et cellules non traitées) afin d’atteindre une concentration finale de sonde de 2 μM. Incuber pendant 10-20 min à RT.IMPORTANT: L’ajout d’une tache nucléaire facilite l’imagerie par microscopie à fluorescence car elle permet de rechercher des cellules d’expectoration d’intérêt sans utiliser les canaux de sonde FRET et donc d’éviter le blanchiment du rapporteur. De plus, la tache d’ADN permet de segmenter les cellules d’expectorations en fonction de la forme de leur noyau. Par exemple, les neutrophiles peuvent être facilement identifiés par leurs noyaux multilobulaires. En outre, des informations supplémentaires sur la viabilité des cellules peuvent être récupérées (les neutrophiles avec un noyau plus segmenté sont plus susceptibles d’être vivants).NOTE: En plus de celle liée à la membrane, l’activité du NE ou du CG lié à l’ADN dans les expectorations humaines peut être mesurée de la même manière au moyen de sondes FRET associées à l’ADN extracellulaire27. Lors de la préparation du mélange maître, H-NE et H-CG peuvent être ajoutés à la concentration de 10 μM et incubés avec des expectorations avant la préparation de la cytospin et de la lame. La quantification du rapport D/A sur l’ADN extracellulaire procède de manière identique à NEmo-2 et mSAM, à la seule différence que les agrégats d’ADN extracellulaire sont segmentés au lieu de cellules individuelles27. Éteindre la réaction en ajoutant 100 μL de PBS glacé et transférer des échantillons sur de la glace. Cytospin le mélange sur des lames de microscopie, sec à l’air, fixer avec du méthanol glacé 10% pendant 10 min, sécher à l’air et monter avec un milieu de montage approprié.REMARQUE: Les lames de microscopie peuvent être conservées à 4 ° C dans l’obscurité jusqu’à un mois jusqu’à une analyse plus approfondie. Acquérir des images de microscopie à l’aide d’un microscope confocal avec un objectif d’huile PL APO 40x ou 63x. Pour augmenter la qualité de l’image et réduire le temps d’acquisition, un mode d’acquisition d’image séquentiel est recommandé. Imagez d’abord la tache nucléaire via une excitation de 633 nm avec la ligne hélium-néon-laser et enregistrez son émission entre 650 et 715 nm. Enregistrer le donneur (coumarine 343) du rapporteur FRET entre 470 et 510 nm lors de l’excitation à 458 nm avec un laser à argon. Acquérir l’émission de l’accepteur sensibilisé (5,6-TAMRA) entre 570 et 610 nm après excitation du seul donneur. Enregistrer l’émission directe de l’accepteur dans un canal séparé entre 470 et 510 nm lors de l’excitation optimale de l’accepteur à 561 nm à l’aide du laser à semi-conducteurs pompé par diode (DPSS). Réglez le trou d’épingle au début de l’expérience et maintenez-le au cours de la séance d’imagerie.REMARQUE: En raison de leur petite taille, l’utilisation d’un objectif de microscope 40x ou 63x est recommandée pour visualiser correctement les neutrophiles. Habituellement, les images sont acquises dans plusieurs canaux consécutifs, en commençant par la longueur d’onde d’excitation plus longue pour empêcher le photobleaching du rapporteur lors de l’acquisition. Imagez au moins 100 cellules par condition pour obtenir des statistiques concluantes. Pour l’analyse d’images de microscopie, utilisez un logiciel approprié: segmentez les cellules et calculez le rapport D / A pixel par pixel, puis calculez la moyenne ou la médiane d’une région d’intérêt donnée qui est sélectionnée manuellement par l’utilisateur. Pour des résultats représentatifs, voir figure 1. Figure 1: Images représentatives et quantification de l’activité de l’EN liée à la membrane sur des neutrophiles isolés à partir d’expectorations de patients atteints de FK. a) Images représentatives en microscopie confocale de neutrophiles pré-incubées (panneau supérieur) pendant 10 min avec 100 μM de Sivelestat (w/) ou laissées non traitées (p/o) (panneau inférieur) avant ajout de NEmo-2 (2 μM) du déclarant. La première colonne à partir de la gauche montre la tache nucléaire, la seconde le canal donneur, la troisième le canal accepteur et la dernière le rapport D/A calculé obtenu en divisant les canaux donneur et accepteur pixel par pixel. Les bordures de la région d’intérêt (neutrophile unique) sont représentées par une ligne pointillée. L’échelle (10 μm) et les barres d’étalonnage (rapport D/A) sont indiquées. b)Boîtes et diagrammes à points montrant le rapport D/A des neutrophiles d’expectorations d’un patient cf représentatif. Les cellules incubées avec des inhibiteurs et les cellules non traitées sont représentées en gris et en bleu, respectivement. Chaque point représente une cellule (N : w/ inhibiteur = 113 et w/o inhibiteur = 96). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Mesure de l’activité des PSN liés à la membrane par cytométrie de flux Ressusciter 1 x 106 cellules dans 100 μL de PBS dans un tube à fond rond en polystyrène FACS de 5 mL et placer le tube sur de la glace. Pour porter les neutrophiles aux expectorations, utilisez les anticorps suivants : CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) et CD66b (1:50). Préparer un mélange maître suffisant pour tous les échantillons. Placez le mélange maître sur la glace dans l’obscurité. Configurez la stratégie de gating comme décrit à la figure 2. Les neutrophiles sont fermées comme 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ événements. Les événements dépendants seront ensuite analysés pour leur activité protéase liée à la membrane pour leur donneur (λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) et accepteur (λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm) intensités fluorescentes moyennes (IMF). Ajouter 2 μL de FcBlock à chaque échantillon et incuber pendant 5 min à RT. Ajouter les anticorps choisis à chaque tube, et incuber pendant 30 min sur la glace dans l’obscurité. Laver les cellules en ajoutant 2 mL de PBS froid, et centrifuger pendant 5 min à 300 x g et 4 °C. Jeter les cellules surnageantes et remises en suspension dans 200 μL de PBS froid. Diviser les 200 μL en deux tubes avec 100 μL chacun et ajouter 5 μL de solution de coloration de viabilité cellulaire dans chaque tube. Placez les tubes sur la glace. Ajouter un inhibiteur spécifique approprié du NSP (pour l’utilisation du NE Sivelestat à une concentration finale de 225 μM, pour l’inhibiteur de la cathepsine G I à 100 μM) dans le tube à essai témoin négatif (NC). Incuber les échantillons à RT pendant 10 min dans l’obscurité. Ajoutez 100 μL de PBS froid à l’échantillon, filtrez-le à travers un filtre de 40 μm dans un tube FACS propre pour éviter le colmatage de l’instrument. Ajouter le rapporteur (pour ne, NEmo-2 à une concentration finale de 4 μM, pour CG, mSAM à une concentration finale de 2 μM) à l’échantillon NC, vortex doucement le tube. Commencez à acquérir des cellules incubées avec l’inhibiteur spécifique pour ajuster légèrement, si nécessaire, les portes ainsi que les tensions des PMT rapporteurs. Enregistrer au moins 1000 neutrophiles. Conserver l’échantillon à température ambiante.Remarque : Bien que plus d’événements peuvent être enregistrés, 1000 cellules assurent un bon compromis entre les statistiques appropriées et le temps d’enregistrement. Procédez avec les tubes suivants (échantillons d’expectorations non traitées) en conséquence. Pour enregistrer les changements du rapport D/A dus à l’activité de la protéase liée à la membrane, enregistrez 1000 neutrophiles de chaque tube toutes les 5 à 10 minutes.REMARQUE: Après un clivage réussi du déclarant FRET, l’intensité des IMF du canal donneur augmentera au fil du temps. L’intensité des IMF du canal accepteur doit diminuer ou rester constante au fil du temps. Calculer le rapport fret en divisant le donneur par les valeurs de canal accepteur pour les échantillons mesurés sur les neutrophiles simples viables fermées. Normaliser les mesures d’échantillon en les divisant par le point de temps correspondant de 0 min (pour des résultats et des analyses représentatifs, voir la figure 2).NOTA : L’enregistrement d’au moins deux points temporels (c.-à-d. 0 et 10 min) est nécessaire pour une mesure dynamique du changement de rapport D/A. Pour normaliser la mesure de l’activité pour chaque échantillon, le rapport D/A mesuré dans les points temporels ultérieurs (p. ex. 10 min) est divisé par le rapport calculé immédiatement après l’addition de la sonde (0 min). Figure 2: Stratégie de contrôle et graphiques représentatifs de l’activité de l’HOMME liée à la membrane mesurée sur des neutrophiles isolés dans des expectorations de patients atteints de FK. a)Pour les neutrophiles d’expectorations de porte, les anticorps suivants sont utilisés: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) et CD66b (1:50). Les neutrophiles sont fermées comme 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ événements. Les événements à comité d’état d’au cœur sont analysés pour leur donneur (λexc= 405 nm, λem= 450/50 nm) et accepteur (λexc= 405 nm, λem= 585/42 nm) intensités moyennes de fluorescence (IMF). b)Histogrammes représentatifs des neutrophiles d’expectoration de CF analysés pour leur activité membrane-liée de Ne. La colonne de gauche montre le signal du donneur, la colonne de droite montre le signal de l’accepteur. La rangée du haut montre les intensités de fluorescence moyennes des cellules traitées avec Sivelestat (w/) pendant 10 minutes avant l’addition du rapporteur. La rangée du bas montre les cellules non traitées (p/o) dont la fluorescence rapporteure est mesurée immédiatement (0 min, gris) et 10 min (bleu) après l’addition du rapporteur. Les neutrophiles sont fermées selon la stratégie indiquée dans le panneau a. c)Le tableau de données montre un ensemble de données représentatif composé de MFI bruts pour le signal donneur et accepteur sur les neutrophiles mesurés sur plusieurs points de temps (0-3-5-10-15-20 min) ainsi que le rapport D / A calculé. Le rapport D/A peut être normalisé, c’est-à-dire au point de temps de 0 min (police blanche). 0 min indique un enregistrement effectué dès que possible après l’ajout du rapporteur au tube d’écoulement avec des cellules d’expectoration colorées. Les données des IMF sont présentées sous forme de moyenne ±’écart-type pour 1000 neutrophiles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.