Monitoring van neutrofiele Elastase en Cathepsine G-activiteit in menselijke Sputummonsters

De volgende protocollen beschrijven de analyse die is uitgevoerd op menselijk sputum. De behandeling van menselijke monsters werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Heidelberg en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten of hun ouders/ wettelijke voogden (S-370/2011) en gezonde controles (S-046/2009). OPMERKING: De volgende protocollen beschrijven het monsterpreparaat en de kwantificering van de activiteit van neutrofiele serine proteasen (NSP’s). De hierin gepresenteerde experimentele procedures zijn gericht op de activiteitsmeting van humaan sputum en neutrofiel elastase14,20,21 (NE) of cathepsine G15 (CG). Kleine aanpassingen in het monstervoorbereidingsprotocol maken de analyse van bloedafnamecellen en tumorhomogenaten echter mogelijk. Bovendien kunnen matrix metalloproteinase 12 en cathepsine S-activiteiten op dezelfde manier worden onderzocht door middel van speciale FRET-sondes22,23,24,25,26. 1. Monstervoorbereiding: celisolatie en supernatantscheiding OPMERKING: Indien mogelijk moet de behandeling van sputum binnen 120 minuten na de slijmopeving worden uitgevoerd en moet het sputum tot verdere verwerking op ijs worden bewaard. Als spontane slijmopwedding van sputum niet mogelijk is, induceer dan sputum zoals eerder beschreven19. Adem kort 200 μg van de β-2-receptor-antagonist salbutamol in voordat u de sputuminductieprocedure start. Adem daarna gedurende 15 minuten een hypertone (6%) zoutoplossing in met behulp van een vernevelaar. Verzamel het verwachte sputum in een petrischaaltje. Scheid de slijmklonters van het speeksel in een Petrischaaltje met behulp van een pipetpunt. Weeg het slijm.OPMERKING: Het gemiddelde gewicht van een slijmmonster is 0,8 g (variërend tussen 0,1 g en 5 g); 0,1 g zijn meestal voldoende om de genoemde procedures uit te voeren. Voeg 4 delen (v/w) van 10% Sputolysine (in PBS) toe aan sputum (bijvoorbeeld: 4 ml 10% Sputolysine voor elke gram sputum).LET OP: Sputolysine bestaat uit geconcentreerde dithiothreitol in fosfaatbuffer, behandel het daarom met zorg. Incubeer het mengsel op kamertemperatuur (RT) gedurende 15 minuten op een schommelende shaker om het slijm op te lossen. Plaats de shaker om veiligheidsredenen in een zuurkast. Blus de reactie door hetzelfde volume koude PBS toe te voegen (bijvoorbeeld: 1 ml koude PBS voor elke ml 10% Sputolysine). Meng door pipetten om een homogene oplossing te verkrijgen. Filtreer het mengsel door een nylon celzeef van 100 μm in een buis van 50 ml. Herhaal de filtratiestap door een nylon celzeef van 40 μm. Centrifugeer de oplossing gedurende 10 min bij 300 x g bij 4 °C. Doe de supernatantfractie voorzichtig in een verse buis en bewaar deze op ijs.OPMERKING: De supernatansfracties kunnen tot nader order bij -20 °C of -80 °C worden bewaard. Resuspend de celkorrel voorzichtig in 500 μL koude PBS en leg deze op ijs.OPMERKING: De celfractie moet onmiddellijk worden verwerkt. 2. Neutrofiele serine protease activiteitsmeting OPMERKING: Hier worden verschillende methoden geïntroduceerd om de NSP-activiteit te kwantificeren door middel van FRET-verslaggevers. De keuze van de technologie wordt bepaald door de specifieke biomedische vraag en het doel van het experiment. De gepresenteerde sondes werden uitgebreid getest op hun specificiteit aan de hand van een reeks longrelevante enzymen14,15. Hoewel de sondes specifiek zijn voor hun doelenzym, controleer altijd de specificiteit van de sonde op het klinische monster van belang. Dit kan worden bereikt door het monster te incuberen met een specifieke proteaseremmer voorafgaand aan de toevoeging van de sonde, die elke toename van de D/A-verhouding zou moeten afschaffen. Oplosbare NSP’s activiteit kwantificering via fluorimeter of plaatlezertestOPMERKING: Proteaseactiviteit in oplosbare fracties van het monster kan worden gedetecteerd met elk instrument dat fluorescentiedetectie kan detecteren.Ontdooi enzymen op ijs. Bewaar NE en CG tot gebruik in een zure opslagbuffer (50 mM natriumacetaat, 200 mM NaCl, pH 5,5) om zelfsplitsing te voorkomen. Om een enzymstandaardcurve in te stellen, bereidt u een 1:2 seriële verdunning van enzym (33,9 – 0,271 nM voor NE; 42,6 – 0,333 nM voor CG) in activeringsbuffer (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl bij pH 7,5). De activeringsbuffer heeft een neutrale pH en maakt het dus mogelijk om enzymatische katalyse efficiënt te laten verlopen. Om de hoogste standaardconcentratie (NE-concentratie: 33,9 nM) te bereiden, verdunt u 1 μL NE (33,9 μM) in 999 μL activeringsbuffer. Om de tweede norm (NE-concentratie: 16,95 nM) voor te bereiden, mengt u 200 μL van de eerste verdunning met 200 μL activeringsbuffer. Ga dienovereenkomstig te werk om de resterende 1:2 verdunningen voor te bereiden. De laatste standaard, die leeg is, bestaat uit pure activeringsbuffer. Het meten van technische duplicaten of drievoud wordt aanbevolen. Probeer tijdens de standaard- en monstervoorbereiding flacons op ijs te houden. Verdun sputummonsters parallel aan het standaardpreparaat in de activeringsbuffer. Verdun de menselijke monsters voordat u hun proteaseactiviteit beoordeelt om in het lineaire bereik van de toename van het signaal van de verslaggever te blijven (donor/acceptor ratio). Als patiëntmonsters onverdund zouden blijven, zou het decolleté te snel gebeuren voor een betrouwbare pasvorm. Aangezien gezond donorspoeum minder actieve proteasen bevat in vergelijking met monsters van CF- en COPD-patiënten, worden over het algemeen verschillende verdunningen uitgevoerd (1:10 voor gezonde sputumsupernatant, 1:20-500 voor sputumsupernatans van COPD- of CF-patiënten).OPMERKING: Om de proteaseactiviteit in monsters waarvan de concentratie onbekend is kwantitatief te meten, moet een standaardcurve met bekende enzymconcentraties parallel worden gemeten, idealiter op dezelfde plaat. De concentratie van actief enzym in menselijk sputum wordt berekend door de in menselijke sputummonsters gemeten hellingen te interpoleren met de hellingen die met de standaardcurven zijn gemeten. Voordat u de monsters klaarmaakt voor meting, stelt u het instrument in. Stel de excitatiegolflengte voor ne fret sonde (NEmo-114) in op 354 nm, en stel de detectie golflengte in op 400 nm voor de donor en 490 nm voor de acceptor. Stel de excitatiegolflengte voor CG FRET-sonde (sSAM15) in op 405 nm en stel de emissie in op 485 (donor) en 580 nm (acceptor). Voeg 40 μL monsters, standaard of blanco, toe aan de putten van een zwarte plaat met een half oppervlak van 96 wells. Om de mastermix met de verslaggevers voor te bereiden (concentratie van de reporter in de mastermix: 10 μM), verdun de sondevoorraad (1 mM in DMSO) 1:100 in activeringsbuffer. Bereid het benodigde mastermixvolume voor door 10 μL x het aantal vereiste plaatputten te vermenigvuldigen. Om de optimale eindconcentratie (2 μM) voor fluorescentiemeting van NEmo-1- en sSAM-verslaggevers te bereiken, voegt u 10 μL van de hoofdmix toe aan elke put (met 40 μL monster, standaard of blanco) en start u de uitlezing. NEmo-1- en sSAM-verslaggevers zullen daarom respectievelijk oplosbare neutrofiele elastase en cathepsine G-activiteit monitoren.OPMERKING: Als er geen reagensinjector beschikbaar is, zorg er dan voor dat u de uitlezing zo snel mogelijk na toevoeging van de monsters aan de verslaggever start. Start de meting van de plaatlezer en registreer de toename van de donor/acceptorverhouding elke 60-90 seconden gedurende ten minste 20 minuten of totdat de toename van het signaal een plateau bereikt. Zodra de gegevens zijn geëxporteerd, berekent u de donor/acceptorverhouding (D/A-verhouding) door de relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) van de donor te delen met de acceptor-RFU voor elk tijdspunt en monster. Bereken het gemiddelde D/A-verhoudingsgemiddelde en de standaardafwijking van elk monster. Bepaal de helling binnen de lineaire groei van de D/A-verhoudingsverandering. De helling is een indicator van de enzymsplitsingssnelheid voor een FRET-sonde. Bereken de concentratie van het actieve enzym in sputum door de lineaire regressiehellingen afgeleid van de menselijke monsters aan te passen aan die berekend op basis van de enzymstandaard. Membraangebonden NSP’s activiteit kwantificering via fluorimeter of plaatlezertest Isoleer sputumcellen zoals hierboven beschreven. Resuspend 3 x 104 cellen in een volume van 40 μL PBS. Voeg de cellen goed toe aan de plaatlezer. Zet het instrument op. Stel de excitatiegolflengte voor membraangebonden NE FRET-sonde (NEmo-214) in op 405 nm en stel de detectiegolflengte in op 485 nm voor de donor en 580 nm voor de acceptor. Stel de excitatiegolflengte voor membraangebonden CG FRET-sonde (mSAM15) in op 405 nm en stel de emissie in op 485 (donor) en 580 nm (acceptor). Om de mastermix met de verslaggevers voor te bereiden, verdunt u de sondevoorraad in activeringsbuffer tot een concentratie van 10 μM. Bereid het benodigde mastermixvolume voor door 10 μL X het aantal vereiste plaatputten te vermenigvuldigen. Om de optimale eindconcentratie (2 μM) voor fluorescentiemeting van NEmo-2- en mSAM-verslaggevers te bereiken, voegt u 10 μL van de hoofdmix toe aan elke put (met 40 μL monster, standaard of blanco) en start u de uitlezing. NEmo-2- en mSAM-verslaggevers zullen daarom respectievelijk membraangebonden neutrofiele elastase en cathepsine G-activiteit volgen.OPMERKING: Een cellulaire negatieve controle kan worden gebruikt, bijvoorbeeld cellen die NSP’s niet actief afscheiden. Bijvoorbeeld, de incubatie van de verslaggevers met 3 x 104 leukocyten voorlopers HL-60 promyelocytische cellen vertegenwoordigt een geldige decolleté negatieve controle. Registreer verandering in donor/acceptor ratio gedurende ten minste 20 minuten of totdat de toename van het signaal een plateau bereikt. Analyseer de gegevens zoals hierboven beschreven. Membraangebonden NSP’s activiteitsmeting via fluorescentiemicroscopieBepaal het aantal voorwaarden dat moet worden geanalyseerd.OPMERKING: Voor elke sputummonstermeting wordt de bereiding en analyse van aanvullende positieve (PC) en negatieve (NC) controle aanbevolen. Resuspendeer voor elke meting 3 x 104 sputumcellen in een volume van 50 μL PBS in een buis van 1,5 ml. Als negatieve controle incubeer sputumcellen met een specifieke remmer (Sivelestat, specifieke NE-remmer of cathepsine-G-remmer I, specifieke CG-remmer, bij een eindconcentratie van 100 μM). Incubeer gedurende 10 minuten bij RT. Als positieve controle moet sputumcellen met het juiste enzym (NE of CG bij respectievelijk 340 nM of 200 nM) gedurende 10 minuten bij RT worden geïncubeerd. Voeg 50 μL PBS met de FRET-reporter en een kernvlek (in een eindverdunning van 1:1000) toe aan elke buis (positieve met controle behandelde cellen, negatieve met controle behandelde cellen en onbehandelde cellen) om een sonde-eindconcentratie van 2 μM te bereiken. Incubeer gedurende 10-20 minuten bij RT.BELANGRIJK: De toevoeging van een kernvlek vergemakkelijkt fluorescentiemicroscopie beeldvorming omdat het mogelijk is om te zoeken naar sputumcellen van belang zonder de FRET-sondekanalen te gebruiken en daarom te voorkomen dat verslaggevers bleken. Bovendien maakt de DNA-vlek het mogelijk om sputumcellen te segmenteren op basis van de vorm van hun kern. Neutrofielen zijn bijvoorbeeld gemakkelijk te herkennen aan hun multilobulaire kernen. Ook kan aanvullende informatie over de levensvatbaarheid van de cellen worden opgehaald (neutrofielen met een meer gesegmenteerde kern hebben meer kans om te leven).OPMERKING: Naast de membraangebonden, kan de activiteit van DNA-gebonden NE of CG in menselijk sputum op dezelfde manier worden gemeten door middel van H-NE en H-CG, extracellulaire DNA-associatieve FRET-sondes27. Bij het bereiden van de mastermix kunnen H-NE en H-CG worden toegevoegd bij de concentratie van 10 μM en worden geïncubeerd met sputum voorafgaand aan cytospin- en diavoorbereiding. De D/A-ratio kwantificering op extracellulair DNA verloopt identiek aan NEmo-2 en mSAM, met als enige verschil dat extracellulaire DNA-aggregaten worden gesegmenteerd in plaats van enkele cellen27. Doof de reactie door 100 μL ijskoud PBS toe te voegen en breng monsters over op ijs. Cytospin het mengsel op microscopie dia’s, aan de lucht drogen, fixeren met ijskoude methanol 10% gedurende 10 minuten, aan de lucht drogen en monteren met een geschikt montagemedium.OPMERKING: De microscopieglaasjes kunnen tot een maand in het donker bij 4 °C worden bewaard tot verdere analyse. Verkrijg microscopiebeelden met behulp van een confocale microscoop met een PL APO 40x of 63x olie objectief. Om de beeldkwaliteit te verhogen en de acquisitietijd te verkorten, wordt een sequentiële beeldverwervingsmodus aanbevolen. Beeld de nucleaire vlek eerst in via 633 nm excitatie met de helium-neon-laserlijn en registreer de emissie tussen 650 en 715 nm. Registreer de donor (cumarine 343) van de FRET-verslaggever tussen 470 en 510 nm bij excitatie bij 458 nm met een argonlaser. Verkrijg de gesensibiliseerde acceptor (5,6-TAMRA) emissie tussen 570 en 610 nm na enige donor excitatie. Registreer de directe acceptoremissie in een afzonderlijk kanaal tussen 470 en 510 nm bij optimale excitatie bij 561 nm met behulp van de diode pumped solid state (DPSS) laser. Stel het pinhole in aan het begin van het experiment en onderhoud tijdens de beeldvormingssessie.OPMERKING: Vanwege hun kleine formaat wordt het gebruik van een 40x of 63x microscoop objectief aanbevolen om neutrofielen goed te visualiseren. Meestal worden beelden verkregen in verschillende opeenvolgende kanalen, te beginnen met de langere excitatiegolflengte om fotobleaching van de verslaggever tijdens acquisitie te voorkomen. Afbeelding ten minste 100 cellen per voorwaarde voor sluitende statistieken. Voor analyse van microscopiebeelden gebruikt u een geschikte software: segmenteer de cellen en bereken de D/A-verhouding per pixel, bereken vervolgens het gemiddelde of de mediaan van een bepaald interessegebied dat handmatig door de gebruiker wordt geselecteerd. Voor representatieve resultaten zie figuur 1. Figuur 1: Representatieve beelden en kwantificering van membraangebonden NE-activiteit op neutrofielen geïsoleerd van CF-patiënt sputum. a) Representatieve confocale microscopiebeelden van neutrofielen die gedurende 10 minuten zijn geïncubeerd (bovenpaneel) met 100 μM Sivelestat (w/) of onbehandeld (w/o) (onderste paneel) vóór toevoeging van reporter NEmo-2 (2 μM). De eerste kolom van links toont de nucleaire vlek, de tweede het donorkanaal, de derde het acceptorkanaal en de laatste de berekende D/A-verhouding verkregen door donor- en acceptorkanalen pixel voor pixel te delen. De grenzen van de regio van belang (enkele neutrofiel) worden afgebeeld als stippellijn. Schaal (10 μm) en kalibratiebalken (D/A-verhouding) zijn aangegeven. b) Box- en dot-plots met de D/A-verhouding van sputum neutrofielen van een representatieve CF-patiënt. Cellen geïncubeerd met remmers en onbehandelde cellen worden respectievelijk in grijs en blauw weergegeven. Elke punt vertegenwoordigt één cel (N: w/inhibitor = 113 en w/o inhibitor = 96). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Membraangebonden NSP’s activiteitsmeting via flowcytometrie Resuspend 1 x 106 cellen in 100 μL PBS in een 5 ml FACS polystyreen ronde bodembuis en plaats de buis op ijs. Gebruik de volgende antilichamen om sputum neutrofielen te gaten: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) en CD66b (1:50). Bereid voldoende mastermix voor alle monsters. Leg de mastermix op ijs in het donker. Stel de gatingstrategie in zoals beschreven in figuur 2. De neutrofielen worden gated als 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ events. De gated events worden vervolgens geanalyseerd op hun membraangebonden proteaseactiviteit voor hun donor (λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) en acceptor (λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm) gemiddelde fluorescentieintensiteiten (MFI’s). Voeg 2 μL FcBlock toe aan elk monster en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Voeg de gekozen antilichamen toe aan elke buis en incubeer gedurende 30 minuten op ijs in het donker. Was cellen door 2 ml koude PBS toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g en 4 °C. Gooi supernatant en resuspend cellen weg in 200 μL koude PBS. Splits de 200 μL in twee buizen met elk 100 μL en voeg in elke buis 5 μL cel levensvatbaarheidskleuringsoplossing toe. Leg buizen op ijs. Voeg een geschikte specifieke NSP-remmer (voor NE-gebruik Sivelestat bij 225 μM eindconcentratie, voor CG-gebruik cathepsine G-remmer I bij 100 μM) toe aan de negatieve controle (NC) reageerbuis. Incubeer de monsters bij RT gedurende 10 minuten in het donker. Voeg 100 μL koude PBS toe aan het monster, filtreer het door een filter van 40 μm in een schone FACS-buis om verstopping van het instrument te voorkomen. Voeg de melder (voor NE, NEmo-2 bij een eindconcentratie van 4 μM, voor CG, mSAM bij een eindconcentratie van 2 μM) toe aan het NC-monster, draai de buis voorzichtig om. Begin met het verkrijgen van cellen geïncubeerd met de specifieke remmer om, indien nodig, de poorten en de spanningen van de verslaggever PMT’s enigszins aan te passen. Neem minstens 1000 neutrofielen op. Bewaar het monster op kamertemperatuur.OPMERKING: Hoewel er meer gebeurtenissen kunnen worden geregistreerd, zorgen 1000 cellen voor een goed compromis tussen de juiste statistieken en de opnametijd. Ga dienovereenkomstig verder met de volgende buizen (onbehandelde sputummonsters). Om veranderingen in de D/A-verhouding als gevolg van membraangebonden proteaseactiviteit vast te leggen, registreert u elke 5 tot 10 minuten 100 neutrofielen uit elke buis.OPMERKING: Na een succesvolle FRET reporter decolleté zal de intensiteit van de MFI’s van het donorkanaal in de loop van de tijd toenemen. De intensiteit van de MFI’s van het acceptorkanaal moet in de loop van de tijd afnemen of constant blijven. Bereken de FRET-verhouding door de donor te delen door de acceptorkanaalwaarden voor de monsters gemeten op de gated viable single neutrophils. Normaliseer monstermetingen door ze te delen met het overeenkomstige tijdspunt van 0 minuten (voor representatieve resultaten en analyse zie figuur 2).OPMERKING: De registratie van ten minste twee tijdspunten (d.w.z. 0 en 10 min) is noodzakelijk voor een dynamische meting van de D/A-verhoudingsverandering. Om de activiteitsmeting voor elk monster te normaliseren, wordt de D/A-verhouding gemeten in latere tijdspunten (bijv. 10 min) gedeeld door de verhouding die onmiddellijk na de toevoeging van de sonde (0 min) wordt berekend. Figuur 2: Gatingstrategie en representatieve plots van membraangebonden NE-activiteit gemeten op neutrofielen geïsoleerd van CF-patiëntsputum. a) Om sputum neutrofielen te gaten worden de volgende antilichamen gebruikt: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) en CD66b (1:50). De neutrofielen worden gated als 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ events. De gated events worden geanalyseerd op hun donor (λexc= 405 nm, λem= 450/50 nm) en acceptor (λexc= 405 nm, λem= 585/42 nm) gemiddelde fluorescentieintensiteiten (MFI’s). b) Representatieve histogrammen van CF sputum neutrofielen geanalyseerd op hun membraangebonden NE-activiteit. De linkerkolom toont het donorsignaal, de rechterkolom toont het acceptorsignaal. De bovenste rij toont gemiddelde fluorescentieintensiteiten van cellen die gedurende 10 minuten met Sivelestat (w/) zijn behandeld voordat de verslaggever wordt opgewaardeerd. De onderste rij toont onbehandelde (w/o) cellen waarvan de fluorescentie van de verslaggever onmiddellijk wordt gemeten (0 min, grijs) en 10 min (blauw) na toevoeging van de verslaggever. Neutrofielen worden gated volgens de strategie in paneel a. c) De gegevenstabel toont een representatieve dataset bestaande uit ruwe MFI’s voor de donor en acceptor signaal op neutrofielen gemeten over verschillende tijdspunten (0-3-5-10-15-20 min) evenals de berekende D/A ratio. De D/A-verhouding kan worden genormaliseerd, d.w.z. tot het tijdspunt van 0 minuten (wit lettertype). 0 min geeft een opname aan die zo snel mogelijk na de toevoeging van de verslaggever aan de stroombuis met bevlekte sputumcellen is gedaan. MFI-gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking voor 1000 neutrofielen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.