Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.
Çapraz Bağlama Kromatin İmmünopresipitasyonu (X-ChIP), konakçı ve/veya patojen kromatin üzerindeki histon izlerinin seviyelerini ve transkripsiyon faktörlerinin doluluğunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Dokulardan kromatin preparatı, hücre kültürü için kullanılanlarla karşılaştırılabilir tekrarlanabilir ve güvenilir protokoller elde etmek için üstesinden gelinmesi gereken ek zorluklar yaratır. Doku bozulması ve fiksasyon, kromatinin etkili bir şekilde kesilmesini sağlamak için kritik adımlardır. Farklı hücre tiplerinin ve kümelerinin bir arada bulunması, optimum parça boyutuna ulaşmak için farklı kesme süreleri gerektirebilir ve kesme tekrarlanabilirliğini engelleyebilir. Bu yöntemin amacı, hem ChIP-qPCR hem de yeni nesil dizileme (NGS) uygulamaları için uygun dondurulmuş dokudan (karaciğer) güvenilir ve tekrarlanabilir konakçı kromatin preparatları elde etmektir. Sıvı azot dokusu pulverizasyonunun ardından homojenizasyonun kombinasyonunun, yalnızca homojenizasyona kıyasla daha fazla tekrarlanabilirliğe yol açtığını gözlemledik, çünkü çoğunlukla verimli bir şekilde kesilebilen ayrışmış tek hücrelerden oluşan bir süspansiyon sağlar. Ayrıca, homojen çapraz bağlama sağlamak için fiksasyon adımı hafif rotasyon altında gerçekleştirilmelidir. Sabit malzeme daha sonra zaman alıcı santrifüjleme gradyanlarından kaçınarak sitoplazmik protein ve patojen DNA’larının ve RNA’larının (uygulanabilir olduğunda) kontaminasyonunu azaltmak için tampon bazlı çekirdek izolasyonu için uygundur. Sonraki sonikasyon nükleer lizizi tamamlayacak ve kromatini keserek seçilen kesme koşullarına göre belirli bir boyut aralığı üretecektir. Boyut aralığı NGS uygulamaları için 100 ila 300 nt arasında olmalıdır, ChIP-qPCR analizi için daha yüksek (300-700 nt) olabilir. Bu tür protokol uyarlamaları, dondurulmuş doku örneklerinden kromatin analizlerini büyük ölçüde iyileştirebilir.
Keşfinden bu yana, memeli hücrelerinde epigenetik düzenleme, bu tür mekanizmaların anlaşılmasının sadece hücre biyolojisinde değil, aynı zamanda hastalık ve tümör biyolojisinde de önemli bilgiler sağlayacağı göz önüne alındığında, giderek artan bir tanıma kazanmıştır1. Ayrıca, enfeksiyöz ajanlar da konakçı epigenetik değişikliklere neden olabilir2 konakçı hücre mekanizması, kalıcı DNA virüsleri 3,4 gibi patojenlerin kromatinini de etkileyebilir. Bu konakçı-patojen etkileşimi enfeksiyon kalıcılığında rol oynuyor gibi görünmektedir. 2
DNA ile geri dönüşümlü bir ilişki yoluyla, histon proteinleri nükleozom adı verilen bir kompleks oluşturur. Nükleozomlar sırayla kromatin olarak bilinen daha yüksek bir organizasyon seviyesine ulaşır. Kromatin yeniden şekillenmesinin, gen ekspresyonunu sıkı bir şekilde düzenlediği, transkripsiyon faktörlerine (TF’ler) erişim izni verdiği veya reddettiği bilinmektedir5. Bu faktörler, RNA polimeraz II’nin (PolII) gen promotörlerine alımını tetikleyebilir veya bloke edebilir ve DNA şablon6’dan mRNA sentezini etkileyebilir. Histon proteinleri, histon kıvrımının her iki ucunu çevreleyen kuyruk7’yi içerir, bu da post-translasyonel modifikasyonlara (PTM’ler) maruz kalabilir ve yapısal kromatin değişiklikleri ile gen transkripsiyonunun sıkı bir şekilde düzenlenmesine izin verir. Histon PTM’lerin çoğu kuyruk N-terminusunda bulunur, asetilasyon ve metilasyon en iyi çalışılan PTM’lerdir, ancak fosforilasyon8, ubikitinasyon9 ve ribozilasyon10 da bildirilmiştir. Bu tür proteinleri karakterize etmek ve incelemek, gen düzenlemesi hakkında derin bir fikir edinmek için gereklidir.
Şu anda, doğrudan DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir avuç köklü yöntem ve araç bulunmaktadır: Elektroforetik mobilite kayma testi (EMSA), Maya tek hibrit tahlil (Y1H) ve DNA ayak izi11. Bununla birlikte, bu yöntemler kendi başına tek DNA-protein etkileşimlerine odaklanır ve genom çapında çalışmalar için geçerli değildir. Bu tekniklerin bir diğer sınırlaması, araştırılan DNA segmentleri ile histon ilişkisinin olmamasıdır. Bu nedenle, bu tür yaklaşımlar in vivo transkripsiyonel makinenin karmaşıklığını yansıtmak için tasarlanmamıştır ve DNA’ya protein bağlanmasını etkileyebilecek (teşvik edebilecek veya inhibe edebilecek) önemli yapısal değişiklikleri12 veya diğer gerekli enzimleri / kofaktörleri13 dikkate almazlar.
Hücrelerin formaldehit (FA) gibi ajanlarla sabitlenmesinin, protein-DNA etkileşimlerinin in vivo anlık görüntüsünü sağlayabileceği fikri, kromatin immünopresipitasyon tahlillerinin (ChIP) gelişimi için temel oluşturmuştur14. Bu, kantitatif PCR (qPCR) teknolojisinin ve oldukça spesifik antikorların mevcudiyeti ile birlikte, ChIP-qPCR testlerinin geliştirilmesine izin verdi. Daha sonra, maliyetleri daha uygun hale gelen yeni nesil dizileme tekniklerinin (NGS) ortaya çıkışı, ChIP deneylerini NGS yaklaşımlarıyla (ChIP-seq) birleştirmeyi kabul etti ve böylece araştırmacılara kromatin düzenlemesinin araştırılmasını sağlayan yeni güçlü araçlar sağladı. Bu tahlillerde, izole edilmiş veya kültürlenmiş hücreler disuccinimidyl glutarat (DSG) ve / veya FA ile sabitlenir, çekirdekler izole edilir, kromatin daha sonra parçalanır ve ilgili antikor tarafından çökeltilir. Bundan sonra DNA, PCR veya NGS yaklaşımları ile saflaştırılır ve analiz edilir. EMSA, Y1H ve DNA ayak izinin aksine, ChIP testleri hücre içindeki protein-DNA etkileşiminin küresel bir anlık görüntüsünü sağlama yeteneğine sahiptir. Bu, esneklik sunar ve aynı numune içinde birden fazla lokusun analizine izin verir. Bununla birlikte, tahlilin doğası gereği, ChIP, nihayetinde, doğrudan protein-DNA etkileşimleriyle ilgilendiğinde, yukarıda belirtilen yöntemlerin hassasiyetini sunmayan, sadece doğrudan etkileşimleri değil, dolaylı etkileşimleri de tespit edebilir.
Hücre kültürü materyalinden kromatin hazırlama protokolleri iyi kurulmuş15 ve yüksek oranda tekrarlanabilir, kullanıcının 1-2 iş günü içinde hem qPCR hem de NGS yaklaşımları için uygun kromatin elde etmesini sağlar. Bununla birlikte, tüm dokulardan yüksek kaliteli kromatin elde etmek, kromatinin optimal fiksasyonunu ve kesilmesini sağlarken doku içindeki hücreleri ayrıştırma ihtiyacı nedeniyle hala bir zorluktur. Ek olarak, farklı doku tiplerinin bileşimi ve morfolojisi değişir, bu nedenle mevcut protokollerin ayarlanmasını gerektirir16,17. Kriyokorunmuş dokunun kullanımı, taze numunelere kıyasla ek zorluklar sunar. Bunun nedeni, kapsamlı malzeme kaybı olmadan tek bir hücre süspansiyonu elde etmenin zorluğudur. Bu, yanlış kesmeye yol açarak aşağı akış uygulamalarını engeller. Bununla birlikte, taze muadili yerine dondurulmuş doku örneklerine erişmek sadece çalışma esnekliğini arttırmakla kalmaz, aynı zamanda uzunlamasına veya karşılaştırmalı çalışmalardan kaynaklanan örneklerle çalışan araştırmacılar için tek seçeneği temsil edebilir. Dondurulmuş doku için bir avuç kromatin hazırlama protokolü yayınlanmıştır. Bunlar çoğunlukla numune çözme ve ardından kıyma, manuel/makine tabanlı ayrışma veya sıvı azot toz haline getirme adımları18,19,20’ye dayanır.
Burada, hem viral hem de konakçı genomlarını analiz etmeyi amaçlayan X-ChIP yaklaşımlarına uygun tekrarlanabilir bir kromatin kesme elde etmek için sıvı azottaki doku pulverizasyonunu havane homojenizasyonu ile birleştiren dondurulmuş sabitlenmemiş karaciğer örnekleri için optimize edilmiş bir kromatin hazırlama yöntemi15 açıklanmaktadır.
Çıtçıtlı dondurulmuş dokudan kromatin preparatı, tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar elde etmek için optimize edilmesi gereken adımların sayısı nedeniyle bir zorluk olmaya devam etmektedir. Daha önce yayınlanmış olanprotokollerin çoğu 16,23, manuel ayrışmadan önce doku kıyma gerektirir (atlama). Numunenin sabitlenmesinden önce protein bozulmasına neden olabilecek adımlardan mümkün olduğunca kaçınmaya çalıştık. Pulverizasyon adımı dondurulmuş karaciğer preparatları24’te zaten kullanılmaktadır ve manuel ayrışmayı daha kolay ve tekrarlanabilir hale getirir (bkz. Şekil 2a). 1.5 mL tüpler için özel olarak tasarlanmış bir harç kullanımı ile (bakınız Protokoller), pulverizasyon işlemi sırasında numune kaybı azalır ve karaciğer biyopsi örnekleri gibi az miktarda dokunun işlenmesine izin verilir. Prensip olarak, herhangi bir taşlama adımı olmadan doğrudan doku homojenizasyonu kullanmak mümkündür; Bununla birlikte, daha önce pulverizasyon yapılmadan doku homojenizasyonu, deneyimlerimize göre daha kötü bir tekrarlanabilirliğe sahiptir ve aşağı akış uygulamaları için sorunların ortaya çıkması daha yüksektir (veriler gösterilmemiştir).
Kromatinin dokulardan hazırlanmasında karşılaşılan sorunların çoğu, bu örneklerin doğasından ve hücre kümelerinin kaliteyi kaybetmeden fiksasyon için yeterince küçük olup olmadığının düzgün bir şekilde kontrol edilememesinden kaynaklanmaktadır. Dahası, her adımda her bir alikotu kontrol etmek, protein bozunma şansını artırmak için zaman alıcı olacaktır.
Fiksasyon (adım 3.9), kromatin preparatının temel ve önemli bir parçasıdır. Dokunun doğası gereği, fiksasyon adımı, doku homojenize edilene kadar ertelenmiştir. Bu tür ertelenmiş fiksasyon adımı, daha homojen bir hücre süspansiyonu üretme avantajına sahiptir. Bununla birlikte, özellikle manipülasyona duyarlı hedefler söz konusu olduğunda, sabitlemenin adım 3.6’dan hemen önce gerçekleştirilmesinin gerekli olabileceğinin farkındayız. Bu, son derece hassas proteinlerin veya PTM’lerin korunmasına yardımcı olur, ancak hücre kümelerinin boyutunu artırabilir, sabitlendiğinde homojen olmayan kesmeye neden olabilir. Protokolde kullanılan FA çözeltisinin konsantrasyonu standarttır, ancak genel fiksasyonu iyileştirmeye çalışmak için değiştirilebilir. Burada seçilen sabitleme süresi, sahada yaygın olarak kullanılan standart koşulları da yansıtır. Sabitleme çözeltisinin daha yüksek konsantrasyonu durumunda, sabitleme süresi azaltılabilirken, daha düşük bir miktar olması durumunda arttırılmalıdır. Operatör, fiksasyon süresindeki bir değişikliğin numunenin aşırı sabitlenmesine yol açabileceğini veya protein bozulmasına yer açabileceğini düşünmelidir. Büyük kompleksleri (veya bir kısmını) ve TF’leri çökeltmeyi hedeflemek durumunda, bir DSG çözeltisi ve ardından bir FA25,26 kullanarak çift adımlı bir sabitleme gerçekleştirmek avantajlı olacaktır. Bu durumda DSG, protein-protein etkileşimlerini stabilize ederken, formaldehit çoğunlukla doğrudan DNA-protein etkileşimleri üzerinde hareket eder27.
Operatör, DNA saflaştırması için adım 6.7’den başlayarak daha hızlı olan ve toksik bileşikler kullanmayan kolon tabanlı bir kit uygulama olasılığını dikkate almalıdır. Bununla birlikte, her zaman kaybedilecek olan belirli miktarda bağlanmamış DNA olacaktır. Bu nedenle, klasik fenol-kloroform ekstraksiyonunu ve ardından EtOH çökeltmesini kullanmanızı öneririz. Ayrıca, agaroz jelini çalıştırmadan önce (adım 7.2), DNA konsantrasyonunu ölçmek ve her kuyucuğun daha net bir resme sahip olması için aynı miktarı yüklemek faydalı olabilir.
Bu protokolün bir sınırlaması, bu protokolü yalnızca insan-karaciğer kimerik farelerinden türetilen karaciğer örneklerini kullanarak araştırdığımız ve kullandığımız gerçeğinden kaynaklanmaktadır28. Kendi başına karaciğer epitel ve bağ dokusundan oluşur29. Hastalık durumunda, fibrotik doku ve yağ dokusu mevcut olabilir30,31 doku bozulması sırasında ek zorluklar yaratır. Bununla birlikte, protokolümüzün ayrışma ve sonikasyon adımlarının optimizasyonu olmadan kemik, kas ve yağ dokusu üzerinde kullanılamayacağını biliyoruz. Unutulmaması gereken, hücre kültürü örneklerinde olduğu gibi hepsine uygun bir protokolün bulunmaması nedeniyle her dokunun bir tür optimizasyona ihtiyaç duymasıdır15. Bununla birlikte, çok az optimizasyonla veya hiç optimizasyon olmadan, bu protokolün akciğer, bağırsak, mide, pankreas veya böbrek dokuları gibi bileşimde karaciğer ile benzerlikleri paylaşan diğer dokulara başarıyla uygulanabileceğine inanıyoruz.
Protokolümüz ayrıca HBV kovalent kapalı DNA epizomu (cccDNA) üzerindeki TF’leri ve histon modifikasyonlarını analiz etmek için başarıyla kullanılmıştır32. Bu, insan Sitomegalovirüsü33 (hCMV) ve insan Adenovirüsleri34 (HAdV) gibi karaciğeri etkileyen diğer viral genomlar için böyle bir yaklaşım uygulama şansını açar. Kaposi Sarkoma Herpes Virüsü35 (KHSV), Herpes Simpleks Virüsü36 (HSV1/2) Polyoma virüsleri, Epstein-Barr Virüsü37 (EBV) gibi diğer dokularda kalıcı bir enfeksiyon oluşturan diğer DNA virüslerini analiz etmenin mümkün olacağı göz ardı edilmemiştir.
The authors have nothing to disclose.
Çalışma, Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından Maura Dandri’ye (SFB 841 A5) hibe ve Hamburg Eyaleti tarafından Araştırma Programı (LFF-FV44: EPILOG) ile desteklenmiştir.
Dr. Tassilo Volz, Yvonne Ladiges ve Annika Volmari’ye teknik yardımları ve makaleyi eleştirel bir şekilde okudukları için teşekkür ederiz. Dr. Thomas Günther ve Prof. Adam Grundhoff, ChIP-qPCR analizi için çok yararlı öneriler ve astar setleri sağladıkları için.
0.22µm sterile syringe filter | Labsolute | 7699822 | |
1.5 mL Safeseal tubes | Sarstedt | 7,27,06,400 | |
6x orange loading dye | Thermofisher | R0631 | |
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Bioruptor NGS | Diagenode | ||
Blade or Scalpel | |||
Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | HN04 | |
Chloroform | Sigma Aldrich (Merck) | C2432 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
Deacetylase Inhibitor | Active Motif | 37494 | |
Dounce tissue grinder set | Sigma Aldrich (Merck) | DWK885300-0001-1EA | |
EDTA 500 mM solution | PanReac AppliChem | A4892 | |
EGTA | Sigma Aldrich (Merck) | E4378 | |
EtBr | Carl Roth | 2218 | Concentration 10mg/mL |
Ethanol absolute | CHEMSOLUTE | 2273 | |
Glycerol | Sigma Aldrich (Merck) | G9012 | |
Glycin | Carl Roth | 0079 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | Concentration: 20mg/mL |
Heating block | |||
HEPES | Sigma Aldrich (Merck) | H4034 | |
LE Agarose | Biozym | 840000 | |
Liquid nitrogen cooled mini mortar | Bel-Art | H37260-0100 | |
MeOH free Formaldehyde 16% | Thermofisher | 28908 | |
NP-40 | Roche | 11332473001 | |
PBS 1x | Thermofisher | 10010015 | |
Pefabloc SC-Protease-Inhibitor | Sigma Aldrich (Merck) | 11429868001 | |
Phase Lock Gel – Heavy | QuantaBio | 2302830 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | Sigma Aldrich (Merck) | P3803 | |
Potassium chloride | Carl Roth | 6781 | |
Potassium hydroxyde | Merck | 105033 | |
Proteinase K | Lucigen | MPRK092 | Concentration: 50 µg/µL |
RNAse A | Lucigen | MRNA092 | Concentration: 5 mg/mL |
SDS 10% solution | PanReac AppliChem | A3950 | |
Sodium carbonate anhydrous | Carl Roth | A135 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich (Merck) | S7653 | |
Sterile Petri dishes | Sarstedt | 83,39,02,500 | |
Tris-HCl solution | Sigma Aldrich (Merck) | T2694 | |
Triton-X100 | Sigma Aldrich (Merck) | X100 |