Ce protocole se concentre sur la préparation de la chromatine à partir de tissus congelés et convient à l’immunoprécipitation de la chromatine par réticulation (X-ChIP) suivie d’une analyse PCR quantitative (X-ChIP-qPCR) ou d’approches de séquençage de nouvelle génération (X-ChIP-seq).
L’immunoprécipitation de la chromatine réticulée (X-ChIP) est une technique largement utilisée pour évaluer les niveaux de marques d’histones et l’occupation des facteurs de transcription sur la chromatine de l’hôte et/ou de l’agent pathogène. La préparation de la chromatine à partir de tissus crée des défis supplémentaires qui doivent être surmontés pour obtenir des protocoles reproductibles et fiables comparables à ceux utilisés pour la culture cellulaire. La perturbation et la fixation des tissus sont des étapes essentielles pour obtenir un cisaillement efficace de la chromatine. La coexistence de différents types de cellules et de grappes peut également nécessiter des temps de cisaillement différents pour atteindre une taille optimale des fragments et entrave la reproductibilité du cisaillement. Le but de cette méthode est d’obtenir des préparations de chromatine hôte fiables et reproductibles à partir de tissus congelés (foie) adaptées à la fois aux applications ChIP-qPCR et de séquençage de nouvelle génération (NGS). Nous avons observé que la combinaison de pulvérisation tissulaire à l’azote liquide suivie d’homogénéisation conduit à une reproductibilité accrue par rapport à l’homogénéisation seule, car elle fournit une suspension constituée principalement de cellules individuelles dissociées qui peuvent être efficacement cisaillées. De plus, l’étape de fixation doit être effectuée sous rotation légère pour fournir une réticulation homogène. Le matériel fixé convient alors à l’isolement des noyaux à base de tampon, afin de réduire la contamination des ADN et des ARN des protéines cytoplasmiques et des agents pathogènes (le cas échéant), en évitant les gradients de centrifugation fastidieux. La sonication ultérieure complétera la lyse nucléaire et cisaillera la chromatine, produisant une gamme de tailles spécifique en fonction des conditions de cisaillement choisies. La plage de taille devrait se situer entre 100 et 300 nt pour les applications NGS, alors qu’elle pourrait être plus élevée (300-700 nt) pour l’analyse ChIP-qPCR. De telles adaptations de protocole peuvent grandement améliorer les analyses de chromatine à partir d’échantillons de tissus congelés.
Depuis sa découverte, la régulation épigénétique dans les cellules de mammifères a gagné en reconnaissance1, considérant que la compréhension de tels mécanismes fournirait des informations clés non seulement en biologie cellulaire, mais aussi en biologie des maladies et des tumeurs. De plus, les agents infectieux peuvent également provoquer des modifications épigénétiques de l’hôte2 tandis que la machinerie des cellules hôtes peut également affecter la chromatine des agents pathogènes, tels que les virus à ADN persistants 3,4. Cette interaction hôte-pathogène semble jouer un rôle dans la persistance de l’infection. deux
Grâce à une association réversible avec l’ADN, les protéines histones forment un complexe appelé nucléosome. Les nucléosomes atteignent à leur tour un niveau d’organisation plus élevé connu sous le nom de chromatine. Le remodelage de la chromatine est connu pour réguler étroitement l’expression des gènes, accordant ou refusant l’accès aux facteurs de transcription (TF)5. Ces facteurs peuvent déclencher ou bloquer le recrutement de l’ARN polymérase II (PolII) sur les promoteurs de gènes, influençant la synthèse de l’ARNm à partir du modèle d’ADN6. Les protéines histones contiennent des queues7, flanquant les deux extrémités du pli des histones, qui peuvent être soumises à des modifications post-traductionnelles (PTM), permettant une régulation étroite de la transcription du gène par des changements structurels de la chromatine. La plupart des PTM d’histones sont situés à l’extrémité N de la queue, l’acétylation et la méthylation étant les PTM les mieux étudiés, bien que la phosphorylation8, l’ubiquitination9 et la ribosylation10 aient également été rapportées. La caractérisation et l’étude de ces protéines sont alors essentielles pour obtenir un aperçu approfondi de la régulation des gènes.
Actuellement, il existe une poignée de méthodes et d’outils bien établis pour étudier les interactions directes ADN-protéine : test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA), test mono-hybride de levure (Y1H) et empreinte ADN11. Cependant, ces méthodes se concentrent en soi sur les interactions ADN et protéines uniques et ne sont pas applicables aux études à l’échelle du génome. Une autre limite de ces techniques est l’absence d’association d’histones avec les segments d’ADN étudiés. Ainsi, de telles approches ne sont pas censées refléter la complexité de la machinerie transcriptionnelle in vivo et elles ne tiennent pas compte des changements structurels importants12 ou d’autres enzymes/cofacteursrequis 13 qui pourraient influencer (favoriser ou inhiber) la liaison des protéines à l’ADN.
L’idée que la fixation des cellules avec des agents comme le formaldéhyde (FA) pourrait fournir un instantané in vivo des interactions protéine-ADN a jeté les bases du développement de tests d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)14. Ceci, associé à la disponibilité de la technologie de PCR quantitative (qPCR) et d’anticorps hautement spécifiques, a permis le développement de tests ChIP-qPCR. Par la suite, l’avènement des techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS), dont les coûts deviennent de plus en plus abordables, a concédé de coupler les expériences ChIP avec les approches NGS (ChIP-seq), fournissant ainsi aux chercheurs de nouveaux outils puissants permettant d’étudier la régulation de la chromatine. Dans ces essais, des cellules isolées ou cultivées sont fixées avec du glutarate de disuccinimidyl (DSG) et/ou de l’AF, les noyaux sont isolés, la chromatine est ensuite fragmentée et précipitée par l’anticorps d’intérêt. Par la suite, l’ADN est purifié et analysé par PCR ou NGS. Contrairement à l’EMSA, à l’Y1H et à l’empreinte ADN, les tests ChIP ont la capacité de fournir un instantané global de l’interaction protéine-ADN dans la cellule. Cela offre une flexibilité et permet l’analyse de plusieurs loci au sein d’un même échantillon. Cependant, en raison de la nature du test, ChIP peut, à terme, détecter non seulement des interactions directes, mais aussi des interactions indirectes, n’offrant pas la précision des méthodes mentionnées ci-dessus, lorsqu’il s’agit d’interactions directes protéine-ADN.
Les protocoles de préparation de la chromatine à partir de matériel de culture cellulaire sont bien établis15 et hautement reproductibles, permettant à l’utilisateur d’obtenir une chromatine adaptée à la fois aux approches qPCR et NGS en 1-2 jours ouvrables. Cependant, l’obtention de chromatine de haute qualité à partir de tissus entiers représente toujours un défi en raison de la nécessité de dissocier les cellules dans le tissu tout en obtenant une fixation et un cisaillement optimaux de la chromatine. En outre, la composition et la morphologie des différents types de tissus varient, ce qui nécessite un ajustement des protocoles existants16,17. L’utilisation de tissus cryoconservés présente des défis supplémentaires par rapport aux échantillons frais. Cela est dû à la difficulté d’obtenir une suspension à une seule cellule sans perte matérielle importante. Cela conduit à un cisaillement inapproprié, entravant les applications en aval. Néanmoins, l’accès à des échantillons de tissus congelés plutôt qu’à la contrepartie fraîche augmente non seulement la flexibilité du travail, mais peut également représenter la seule option pour les chercheurs travaillant avec des échantillons provenant d’études longitudinales ou comparatives. Une poignée de protocoles de préparation de la chromatine pour les tissus congelés ont été publiés. Celles-ci sont principalement basées sur la décongélation des échantillons suivie des étapes de hachage, de dissociation manuelle / mécanique ou de pulvérisation à l’azote liquide18,19,20.
Nous décrivons ici une méthode optimisée de préparation de la chromatine15 pour des échantillons de foie congelés non fixés, qui combine la pulvérisation des tissus dans l’azote liquide avec l’homogénéisation du pilon, pour obtenir un cisaillement de la chromatine reproductible adapté aux approches X-ChIP visant à analyser à la fois les génomes viraux et hôtes.
La préparation de la chromatine à partir de tissus congelés reste un défi en raison du nombre d’étapes qui doivent être optimisées afin d’obtenir des résultats reproductibles et fiables. La plupart des protocoles déjà publiés 16,23 nécessitent un hachage tissulaire avant la dissociation manuelle (décollage). Nous avons essayé d’éviter autant que possible les étapes qui pourraient provoquer une dégradation des protéines avant la fixation de l’échantillon. L’étape de pulvérisation est déjà utilisée dans les préparations hépatiques congelées24 et rend la dissociation manuelle plus facile et reproductible (voir figure 2a). Avec l’utilisation d’un mortier spécialement conçu pour les tubes de 1,5 mL (voir Protocoles), la perte d’échantillons pendant le processus de pulvérisation est réduite, ce qui permet de traiter de petites quantités de tissu telles que des échantillons de biopsie du foie. En principe, il est possible d’utiliser l’homogénéisation directe des tissus sans aucune étape de broyage; Cependant, l’homogénéisation tissulaire sans pulvérisation préalable a une moins bonne reproductibilité selon notre expérience et l’apparition de problèmes pour les applications en aval était plus élevée (données non présentées).
La plupart des problèmes rencontrés lors de la préparation de la chromatine à partir de tissus proviennent de la nature de ces échantillons et de l’incapacité de vérifier correctement si les amas cellulaires sont suffisamment petits pour être fixés sans perte de qualité. De plus, la vérification de chaque aliquote à chaque étape prendrait beaucoup de temps, ce qui augmenterait les chances de dégradation des protéines.
La fixation (étape 3.9) est une partie fondamentale et cruciale de la préparation de la chromatine. En raison de la nature du tissu, l’étape de fixation a été retardée jusqu’à ce que le tissu soit homogénéisé. Une telle étape de fixation différée a l’avantage de produire une suspension cellulaire plus homogène. Cependant, nous reconnaissons que dans le cas de cibles particulièrement sensibles à la manipulation, il peut être nécessaire d’effectuer la fixation juste avant l’étape 3.6. Cela aiderait à protéger les protéines extrêmement sensibles ou PTM, bien que cela puisse augmenter la taille des amas cellulaires, ce qui, lorsqu’il est fixé, peut entraîner un cisaillement non homogène. La concentration de la solution FA utilisée dans le protocole est standard, cependant, elle peut être modifiée pour essayer d’améliorer la fixation globale. Le temps de fixation choisi ici reflète également les conditions standard couramment utilisées sur le terrain. En cas de concentration plus élevée de la solution fixatrice, le temps de fixation peut être réduit, tandis qu’en cas de quantité inférieure, il doit être augmenté. L’opérateur doit considérer qu’une modification du temps de fixation peut soit entraîner une fixation excessive de l’échantillon, soit laisser place à la dégradation des protéines. Dans le cas de viser à précipiter de gros complexes (ou une partie de ceux-ci) et des TF, il serait avantageux d’effectuer une fixation en double étape en utilisant une solution DSG suivie d’une solution FA25,26. Dans ce cas, le DSG stabiliserait les interactions protéine-protéine, tandis que le formaldéhyde agit principalement sur les interactions directes ADN-protéine27.
L’opérateur doit tenir compte de la possibilité de mettre en œuvre un kit à base de colonne pour la purification de l’ADN à partir de l’étape 6.7, qui est plus rapide et n’utilise pas de composés toxiques. Cependant, il y aura toujours une certaine quantité d’ADN non lié qui sera perdue. Pour cette raison, nous suggérons d’utiliser l’extraction classique phénol-chloroforme suivie d’une précipitation EtOH. De plus, avant d’exécuter le gel d’agarose (étape 7.2), il pourrait être avantageux de mesurer la concentration d’ADN et de charger la même quantité pour chaque puits afin d’avoir une image plus claire.
Une limite de ce protocole découle du fait que nous avons exploré et utilisé ce protocole uniquement en utilisant des échantillons de foie dérivés de souris chimériques humaines28. En soi, le foie est constitué de tissu épithélial et conjonctif29. En cas de maladie, du tissu fibrotique et du tissu adipeux peuvent être présents30,31, créant des défis supplémentaires lors de la perturbation des tissus. Cependant, nous reconnaissons que notre protocole ne peut pas être utilisé sur les os, les muscles et le tissu adipeux sans optimisation des étapes de dissociation et de sonication. Il est à noter que chaque tissu nécessite une sorte d’optimisation en raison de l’absence d’un protocole adapté à tous comme pour les échantillons de culture cellulaire15. Nous pensons, cependant, qu’avec peu ou pas d’optimisation du tout, ce protocole pourrait être appliqué avec succès à d’autres tissus qui partagent des similitudes avec le foie dans la composition, comme les tissus pulmonaires, intestinaux, estomac, pancréas ou rénaux.
Notre protocole a également été utilisé avec succès pour analyser les TF et les modifications des histones sur l’épisome d’ADN fermé par covalence du VHB (ADNcc)32. Cela ouvre la possibilité d’appliquer une telle approche à d’autres génomes viraux affectant le foie tels que le cytomégalovirushumain 33 (hCMV) et les adénovirushumains 34 (HAdV). Il n’est pas exclu qu’il soit possible d’analyser d’autres virus à ADN qui établissent une infection persistante dans d’autres tissus comme le virus de l’herpès du sarcome de Kaposi35 (KHSV), le virus de l’herpès simplex36 (HSV1/2), le virus d’Epstein-Barr37 (EBV).
The authors have nothing to disclose.
L’étude a été soutenue par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) par une subvention à Maura Dandri (SFB 841 A5) et par l’État de Hambourg avec le programme de recherche (LFF-FV44: EPILOG).
Nous tenons à remercier le Dr Tassilo Volz, Yvonne Ladiges et Annika Volmari pour leur aide technique et pour la lecture critique du manuscrit. Le Dr Thomas Günther et le professeur Adam Grundhoff pour avoir fourni des suggestions très utiles et les ensembles d’amorces pour l’analyse ChIP-qPCR.
0.22µm sterile syringe filter | Labsolute | 7699822 | |
1.5 mL Safeseal tubes | Sarstedt | 7,27,06,400 | |
6x orange loading dye | Thermofisher | R0631 | |
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Bioruptor NGS | Diagenode | ||
Blade or Scalpel | |||
Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | HN04 | |
Chloroform | Sigma Aldrich (Merck) | C2432 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
Deacetylase Inhibitor | Active Motif | 37494 | |
Dounce tissue grinder set | Sigma Aldrich (Merck) | DWK885300-0001-1EA | |
EDTA 500 mM solution | PanReac AppliChem | A4892 | |
EGTA | Sigma Aldrich (Merck) | E4378 | |
EtBr | Carl Roth | 2218 | Concentration 10mg/mL |
Ethanol absolute | CHEMSOLUTE | 2273 | |
Glycerol | Sigma Aldrich (Merck) | G9012 | |
Glycin | Carl Roth | 0079 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | Concentration: 20mg/mL |
Heating block | |||
HEPES | Sigma Aldrich (Merck) | H4034 | |
LE Agarose | Biozym | 840000 | |
Liquid nitrogen cooled mini mortar | Bel-Art | H37260-0100 | |
MeOH free Formaldehyde 16% | Thermofisher | 28908 | |
NP-40 | Roche | 11332473001 | |
PBS 1x | Thermofisher | 10010015 | |
Pefabloc SC-Protease-Inhibitor | Sigma Aldrich (Merck) | 11429868001 | |
Phase Lock Gel – Heavy | QuantaBio | 2302830 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | Sigma Aldrich (Merck) | P3803 | |
Potassium chloride | Carl Roth | 6781 | |
Potassium hydroxyde | Merck | 105033 | |
Proteinase K | Lucigen | MPRK092 | Concentration: 50 µg/µL |
RNAse A | Lucigen | MRNA092 | Concentration: 5 mg/mL |
SDS 10% solution | PanReac AppliChem | A3950 | |
Sodium carbonate anhydrous | Carl Roth | A135 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich (Merck) | S7653 | |
Sterile Petri dishes | Sarstedt | 83,39,02,500 | |
Tris-HCl solution | Sigma Aldrich (Merck) | T2694 | |
Triton-X100 | Sigma Aldrich (Merck) | X100 |