Isolamento e imaging time-lapse di cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo primarie per analizzare gli attributi del movimento collettivo

Lo sviluppo del palato è stato ampiamente studiato in quanto i difetti della palatogenesi portano alla palatoschisi, un difetto di nascita comune che si verifica in casi isolati o come parte di centinaia di sindromi^1,2. Lo sviluppo del palato embrionale è un processo dinamico che coinvolge il movimento e la fusione del tessuto embrionale. Questo processo può essere suddiviso in quattro fasi principali: 1) induzione di ripiani palatali, 2) crescita verticale dei ripiani palatali accanto alla lingua, 3) elevazione dei ripiani palatali sopra la lingua e 4) fusione dei ripiani palatali alla linea mediana^1,3,4. Negli ultimi decenni, sono stati identificati molti mutanti di topo che manifestano palatoschisi^5,6,7,8. La caratterizzazione di questi modelli ha indicato difetti nelle fasi di induzione, proliferazione e fusione della mensola palatale; tuttavia, i difetti di elevazione della mensola palatale sono stati rari. Pertanto, comprendere le dinamiche dell’elevazione della mensola palatale è un’area di ricerca intrigante.

Un’attenta analisi di alcuni mutanti di topo con difetti di elevazione della mensola palatale ha portato al modello attuale che mostra che la regione molto anteriore della mensola palatale sembra capovolgersi, mentre un movimento da verticale a orizzontale o “rimodellamento” dei ripiani palatali si verifica nelle regioni medio-posteriori del palato^{1,3,4, 9,10,11}. L’epitelio del bordo mediale della mensola palatale probabilmente avvia la segnalazione necessaria per questo rimodellamento, che viene quindi guidato dal mesenchima della mensola palatale. Recentemente, molti ricercatori hanno identificato il ritardo di elevazione della mensola palatale in modelli murini che hanno mostrato aderenze orali transitorie che coinvolgono scaffali palatali^12,13. Il rimodellamento mesenchimale comporta la riorganizzazione delle cellule per creare un rigonfiamento in direzione orizzontale, mentre contemporaneamente ritrae la mensola palatale nella direzione verticale^9,10,14. Tra i diversi meccanismi proposti per influenzare l’elevazione della mensola palatale e il rimodellamento mesenchimale sottostante ci sono la proliferazione cellulare^15,16,17,i gradienti chemiotattici¹⁸e i componenti della matrice extracellulare^19,20. È sorta una domanda importante: il ritardo di elevazione della mensola palatale osservato nei topi carenti di Specc1lè anche in parte dovuto a un difetto nel rimodellamento della mensola palatale, e questo difetto di rimodellamento potrebbe manifestarsi in un difetto intrinseco nel comportamento delle cellule MEPM primarie²¹?

Le cellule MEPM primarie sono state utilizzate in campo craniofacciale per molti studi che coinvolgono l’espressione genica^{22, 23,24,25, 26,27,28,29}e alcuni che coinvolgono la proliferazione^30,31 e la migrazione^25,31,32 , ma nessuno per l’analisi collettiva del comportamento cellulare. L’imaging time-lapse delle cellule MEPM è stato eseguito in coltura 2D e saggi di riparazione delle ferite per dimostrare che le cellule MEPM mostravano movimento direzionale e formavano flussi cellulari dipendenti dalla densità-attributi del movimento collettivo²¹. Inoltre, le cellule mutanti Specc1l hanno formato flussi cellulari più stretti e hanno mostrato traiettorie di migrazione cellulare altamente variabili. Si ritiene che questa mancanza di motilità coordinata contribuisca al ritardo dell’elevazione del palato negli embrioni mutanti Specc1l ^13,21. Pertanto, questi saggi relativamente semplici che utilizzano cellule MEPM primarie possono servire come proxy per studiare il rimodellamento mesenchimale durante l’elevazione della piattaforma palatale. Questo documento descrive l’isolamento e la coltura delle cellule MEPM primarie, nonché l’imaging e l’analisi time-lapse, per i test 2D e di riparazione delle ferite.