Das Protokoll beschreibt, wie mit dem φC31-System ortsgerichtete Modifikationen im Genom von Anopheles-Malariamücken erreicht werden können. Zu den beschriebenen Modifikationen gehören sowohl die Integration als auch der Austausch transgener Kassetten im Genom von attP-tragenden Andockleitungen.
Die funktionelle Genomanalyse und verwandte Strategien zur genetischen Kontrolle von Malaria beruhen auf validierten und reproduzierbaren Methoden, um das Genom von Anopheles-Mücken genau zu modifizieren. Unter diesen Methoden ermöglicht das φC31-System eine präzise und stabile ortsgerichtete Integration von Transgenen oder die Substitution integrierter transgener Kassetten durch Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE). Diese Methode beruht auf der Wirkung der Streptomyces φC31 Bakteriophagen-Integrase, um die Rekombination zwischen zwei spezifischen Bindungsstellen namens attP (abgeleitet vom Phagen) und attB (abgeleitet vom Wirtbakterium) zu katalysieren. Das System verwendet ein oder zwei attP-Stellen, die zuvor in das Mückengenom integriert wurden, und attB-Stellen in der Spendervorlagen-DNA. Hier veranschaulichen wir, wie das Genom von attP-tragenden Anopheles-Dockinglinien mit zwei Plasmiden stabil modifiziert werden kann: einem attB-markierten Spender, der die Integrations- oder Austauschvorlage trägt, und einem Helferplasmid, das für die φC31-Integrase kodiert. Wir berichten über zwei repräsentative Ergebnisse der φC31-vermittelten ortsgerichteten Modifikation: die einmalige Integration einer transgenen Kassette in An. stephensi und RMCE in An. gambiae-Mücken. φC31-vermittelte Genommanipulation bietet den Vorteil einer reproduzierbaren Transgenexpression aus validierten, fitnessneutralen genomischen Stellen, die vergleichende qualitative und quantitative Analysen von Phänotypen ermöglicht. Die standortorientierte Natur der Integration vereinfacht auch die Validierung der einzelnen Einfügestelle und des Paarungsschemas erheblich, um eine stabile transgene Linie zu erhalten. Diese und weitere Eigenschaften machen das φC31-System zu einem wesentlichen Bestandteil des genetischen Werkzeugkastens für die transgene Manipulation von Malariamücken und anderen Insektenvektoren.
Die Fähigkeit, das Genom von Mückenvektoren von Krankheiten zuverlässig und reproduzierbar zu modifizieren, hat die in vivo funktionelle Validierung von Genen gestärkt und die Türen zu realisierbaren genetischen Vektorkontrollstrategien geöffnet, wie sie auf Anopheles-Mücken abzielen, die Malaria übertragen1.
Die frühe Mücken-Genom-Editierung stützte sich ausschließlich auf die transponierbare Elementtransformation (TE), wobei PiggyBac das am häufigsten verwendete Transposon in Anopheles war2,3,4. Die zufällige Natur der TE-Integration kann jedoch zu unerwünschten Modifikationen wie Gen-Knockouts (Insertionsmutagenese) und signifikanten Positionseffekten auf die Transgenexpression führen5,6,7,8. Mehrfacheinfügungen kommen auch bei der Verwendung von piggyBac5,9 häufig vor, was die Validierung und Isolierung transgener Linien mit einzelnen Einfügungen mühsam macht. Weitere Nachteile sind ihre potenzielle Remobilisierung, wie sie in der Keimbahn von Anopheles stephensi beobachtet wird, wenn eine Quelle für PiggyBac-Transposase10,11,12 bereitgestellt wird, und ihre begrenzte Größe der DNA-Ladung (10-15 kb Länge), wobei die Transformationseffizienz mit zunehmender Größe des Spenderplasmids abnimmt13,14.
Um diese Probleme zu umgehen, wurden standortgesteuerte Integrationsansätze eingeführt. Die häufigste ortsgerichtete Genommodifikation bei Moskitos ist diejenige, die durch das φC31-System vermittelt wird (Abbildung 1a). Dies wird durch eine virale Integrase angetrieben, die die Rekombination zwischen zwei heterospezifischen Bindungsstellen (att) katalysiert, die natürlich im Genom des Bakteriophagen φC31 (attP) und im Streptomyces-Bakterium-Wirt (attB)15 vorkommen. Die Rekombination der beiden Standorte ist unidirektional und führt zur Bildung von Hybridstellen (attL und attR). Die Rekombination solcher Hybridstellen (die zur DNA-Exzision führt) würde nicht nur das Vorhandensein einer aktiven viralen Integrase, sondern auch eines anderen Phagen-kodierten Rekombinationsfaktors erfordern16,17. So wird ein stabiler Integrationsstandort generiert, der das Problem einer möglichen unerwünschten Remobilisierung entlastet15. Darüber hinaus ermöglicht das System die Integration großer Ladungen (z. B. integration von >100 kb-Konstrukten wurde in D. melanogaster18 berichtet), wodurch die Tragfähigkeiten erheblich erhöht werden. Die Integration erfolgt in einem einzigen vordefinierten genomischen Locus, was die Validierung der Insertion und des Paarungsschemas erheblich vereinfacht, um eine stabile transgene Linie zu erhalten. Schließlich ermöglicht die ortsgerichtete Natur der Integration eine Normalisierung der Expression, da sich alternative Transgene am selben Ort befinden und daher im selben benachbarten genomischen Kontext reguliert werden. In der Tat ist eine der Hauptanwendungen der Technik der direkte Vergleich von Phänotypen, die von verschiedenen Transgenen nach der Insertion in einen identischen Locus verliehen werden.
Das Erreichen einer φC31-vermittelten Integration umfasst zwei Phasen: Phase I ist die Schaffung transgener Andocklinien, die attP-Standorte transportieren, und Phase II ist die standortgerichtete Integration einer attB-flankierten Ladung in das Genom der Andocklinie19. Die Erstellung von Phase-I-Dockinglinien stützte sich auf die TE-vermittelte zufällige Integration von attP-markierten Konstrukten und beinhaltete daher einen ersten mühsamen Prozess (einschließlich Southern Blot- und inverser PCR-Analysen an einzelnen weiblichen Nachkommen), um transgene Linien zu isolieren und zu validieren, die ein einziges Integrationsereignis an einzigartigen, transkriptionell aktiven und fitnessneutralen genomischen Orten tragen. Dennoch wurden in An. gambiae1,20,21,22 und in An. stephensi23,24,25 mehrere Andocklinien für die φC31-vermittelte Einzelintegration entwickelt und validiert (Tabelle 1). Jede dieser Linien variiert in Bezug auf die genomische Lage der Andockstelle und den stammspezifischen genetischen Hintergrund und aus ihnen kann eine Vielzahl neuer transgener Linien geschaffen werden. Die komplexe Validierung von TE-vermittelten Integrationen zur Herstellung von Docking-Linien kann nun durch die CRISPR/Cas9-Technologie umgangen werden26; Dies beruht jedoch auf dem A-priori-Wissen über neutrale Loci, die anvisiert werden sollen, und ihre umgebenden Sequenzen.
Die φC31-vermittelte Integration wurde umfassend auf die Genom-Editierung von Insekten aus dem Modellorganismus D. melanogaster27, den Moskitos Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 und An. stephensi24 sowie anderen Insekten wie Ceratitis capitata30 und Bombyx mori31 angewendet.
Eine Einschränkung der φC31-vermittelten Integration, insbesondere im Hinblick auf mögliche Feldfreisetzungen zur Vektorkontrolle, ist die Integration des gesamten attB-tragenden Spenderplasmids in das Mückengenom, einschließlich unerwünschter Sequenzen wie Antibiotikaresistenz-Genmarker und Plasmid-Backbone-Komponenten bakteriellen Ursprungs. Um dies zu adressieren, wurde eine Modifikation des Standardsystems, rekombinase-vermittelter Kassettenaustausch (RMCE), implementiert, die den präzisen Ersatz einer zuvor integrierten transgenen Kassette durch eine neue Donor-DNA ermöglicht (Abbildung 1b). Dies wird durch die Verwendung von zwei invertierten Att-Stellen erreicht, die die Spender- und Empfängerkassetten an jedem Ende flankieren, was dazu führt, dass zwei unabhängige Rekombinationsereignisse gleichzeitig stattfinden, was zu einem Kassettenaustausch ohne Integration des Plasmid-Backbones führt. Dieses verbesserte Design umgeht die Integration unerwünschter Sequenzen und erweitert die Anwendung von φC31-Systemen um beispielsweise die Integration von nicht markierten DNA-Ladungen durch Screening auf den Verlust eines zuvor integrierten Fluoreszenzmarkers32.
RMCE wurde zuerst mit D. melanogaster32 erreicht und später erfolgreich auf Nicht-Modellinsekten wie An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 und B. mori35 angewendet. Mehrere Dockinglinien für RMCE wurden in An. gambiae5,9,26 entwickelt und validiert (Tabelle 1). Unseres Wissens muss RMCE noch in anderen Anopheles-Vektorarten erforscht werden.
Bisher wurde das φC31-System で anopheles-Mücken weit verbreitet eingesetzt, um eine Vielzahl von Molekülen einzuführen und zu untersuchen, darunter Malaria-Effektoren19,24,36, Komponenten des GAL4/UAS-Systems zur Überexpression und Knockdown-Gene für Insektizidresistenzstudien9,33, regulatorische Elemente, Reportergene5,21,37 und Gene-Drive-Elemente26 ,38.
Dieses Protokoll beschreibt, wie 1) die standortgerichtete Integration einer attB-flankierten Ladung und 2) rmCE eines von invertierten attB-Stellen flankierten Konstrukts in das Genom der Anopheles-Docking-Linien durchgeführt werden. Dies wird durch die Verwendung von zwei Plasmiden erreicht: einem Donor-attB-markierten Plasmid, das das transgen von Interesse trägt, und einem Helferplasmid, das die φC31-Integrase exprimiert. Die wichtigsten Malaria-Vektoren An. gambiae und An. stephensi werden als spezifische Beispiele verwendet, diese Protokolle sind jedoch auf andere Anopheles-Arten anwendbar.
Abbildung 1. Ortsgerichtete Genommodifikationen, Einzelintegration und Rekombinase-vermittelter Kassettenaustausch (RMCE) unter Verwendung des φC31-Systems. Die φC31-Integrase (INT, grauer Doppelpfeil) katalysiert die Rekombination zwischen der attB-Stelle(n) (violett gestreift), die in einem Donorplasmid vorhanden ist, und der attP-Stelle(n) (blau gestreift), die in einer aufnehmenden Andocklinie vorhanden ist, was zur Bildung von Hybridstellen attL und attR führt. A) Die Integration wird erreicht, wenn einzelne attB– und attP-Standorte rekombiniert werden und zu zwei integrierten Markern (blau und rot) führen. B) RMCE tritt auf, wenn zwei attB/P-Stellen gleichzeitig rekombinieren und dazu führen, dass die Kassette zwischen den Att-Stellen der Andocklinie (blauer Marker) durch die vom Donorplasmid (roter Marker) getragene ersetzt wird. C) Partielle Nukleotidsequenzen von attP (blau) und attB (violett) und die Hybridstellen attL/R. Die Rekombination erfolgt zwischen den schwarz hervorgehobenen “TT”-Kernsequenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das genaue Design von attB-markierten Plasmiden, die mit der Docking-Linie ihrer Wahl kompatibel sind, ist für den Erfolg des Experiments von größter Bedeutung. Die Wahl des Markers, der für das Screening von Transformationsmitteln verwendet wird, einschließlich der Fluoreszenzfarbe und ihres Expressionsmusters, die dem bereits in der Andocklinie vorhandenen Muster unterliegen, muss sorgfältig geprüft werden. Es ist notwendig, fluoreszierende Marker zu verwenden, die leicht unterscheidbar sind: Gute Markerkombinationen umfassen RFP (rot) / CFP (cyan), RFP (rot) / GFP (grün), RFP (rot) / YFP (gelb) und YFP (gelb) / CFP (cyan), während kombinationen, die vermieden werden sollten, YFP (gelb) / GFP (grün) und CFP (cyan) / GFP (grün) sind. Der 3xP3-Promotor39, spezifisch für die Augen und das Nervenstrang, wird am häufigsten verwendet, um die Expression von fluoreszierenden Markern für die Mückentransgenese zu steuern. Tatsächlich nutzen alle derzeit verfügbaren Anopheles-Dockinglinien diesen Promoter. Alternative regulatorische Regionen sind die des An. gambiae-Polyubiquitin-Gens (PUBc)5 oder des viralen Promotors IE120, die die Expression in mehreren Geweben antreiben. Wenn sie zusammen mit 3xP3 verwendet werden, würden diese Promotoren die möglichen Farbkombinationen und sogar die Verwendung desselben Fluorophors erweitern. Die angegebenen Promotoren sind während des gesamten Lebenszyklus der Mücke aktiv, was ein Screening und eine Fluoreszenzüberwachung in allen Lebensstadien ermöglicht. Eine zusätzliche Überlegung beim Plasmiddesign ist die Größe der zu integrierenden oder auszutauschenden Ladung. Während das φC31-System bemerkenswerte Tragfähigkeiten hat18, sollte berücksichtigt werden, dass die Größe des Donorplasmids im Allgemeinen negativ mit der Transformationseffizienz korreliert22.
Im beschriebenen Protokoll ist die Quelle der Integrase ein Helferplasmid, das das Enzym ubiquitär exprimiert40. Das ubiquitäre Vorhandensein der Integrase kann zur Umwandlung von Körperzellen führen, wenn Mikroinjektionen nicht genau auf den Bereich gerichtet sind, in dem sich die Keimbahn bildet. Während solche Transformationsereignisse verloren gehen, da sie nicht vererbbar sind, können somatische Effekte die Fitness injizierter Individuen verringern. Um dies zu vermeiden und die Umwandlungseffizienz zu erhöhen, kann die Integraseexpression auf die Keimbahn beschränkt werden, beispielsweise durch Verwendung des Vasapromotors22,26. Andere Protokolle beschreiben die Verwendung von in vitro transkribierter Boten-RNA (mRNA) als Quelle der φC31-Integrase19,24,43. Dies beinhaltet jedoch die mühsame Herstellung von mRNA und erfordert einen sorgfältigen Umgang mit der Injektionsmischung und die Verwendung von RNase-freien Reagenzien, um einen Abbau zu vermeiden. Plasmidquellen der Integrase haben sich sowohl in An. gambiae9,21,22,26,33,37 als auch in An. stephensi (A.A. persönliche Kommunikation) als zuverlässig erwiesen und führen zu einer effizienten Transformation und sind daher unsere bevorzugte Option. Eine weitere Option für die Integrase-Abgabe ist die In-vivo-Produktion in selbstdockenden Helferleinen. Solche Linien wurden in An. gambiae erzeugt, die die φC31-Integrase unter der Regulation der keimbahnspezifischen Promotor-Nanos exprimieren und zu einer verbesserten Überlebens- und Transformationseffizienz führen20. Es müssen jedoch mögliche Fitnessbelastungen durch die In-vivo-Produktion des Integrase-Enzyms an der Hilfslinie berücksichtigt werden.
Wie bei anderen transgenen Techniken muss der Aufzucht und Kreuzung von Individuen, die aus injizierten Embryonen stammen, besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden, um die Chancen auf die Gewinnung von Transformationsmitteln zu maximieren. Personen, die das Transgen stabil geerbt haben, können zunächst an den G1-Nachkommen gewonnen werden. Frühe Anzeichen einer möglichen Transformation können jedoch durch das Vorhandensein einer vorübergehenden episomalen Expression des fluoreszierenden Markers in den Analpapillen und/oder Nervensträngen der ersten und zweiten Larven von G0 unter Verwendung des 3xP3-Promotors43 bewertet werden. Während das Vorhandensein von vorübergehender Fluoreszenz auf eine erfolgreiche Plasmidabgabe hindeutet, garantiert sie keine vererbbare Keimbahntransformation. Ebenso schließt das Fehlen eines transienten Ausdrucks eine erfolgreiche Transformation nicht aus. Dennoch wurde beobachtet, dass vorübergehend positive Individuen eher transgene Nachkommen hervorbringen als vorübergehend negative43,48. In fachkundigen Händen kann die Aufzucht und Kreuzung von nur positiven Individuen eine Option sein, um die Anzahl der Mücken zu reduzieren. Angesichts der Bedeutung und Zerbrechlichkeit kleiner G0-Larven ist jedoch immer noch die geringste Manipulation ratsam und die Aufzucht aller G0-Individuen wird immer empfohlen.
Das in diesem Protokoll beschriebene Paarungsschema wurde entwickelt, um die Wahrscheinlichkeit der Paarung zu maximieren und unabhängige Transformationsereignisse zu isolieren. Wenn jedoch Insektenraum oder Personalverfügbarkeit ein Problem darstellt, können G0-Erwachsene nach Geschlecht in Einzelkäfigen zusammengefasst werden, wenn genügend gegengeschlechtliche Personen zur Verfügung gestellt werden. Ein solches Setup ermöglicht keine Unterscheidung zwischen mehreren Transformationsereignissen, die bei Individuen aus demselben Käfig auftreten. Je nach Versuchsaufbau wird während des Screening-Prozesses mit dem Vorhandensein eines doppelten (einfache Integration) oder eines einfachen (RMCE) Markers gerechnet. In einzelnen Integrationsexperimenten ist es wichtig, das Vorhandensein des ursprünglichen Markers von der Andocklinie zu überprüfen, während es in RMCE wichtig ist, den Verlust des zuvor integrierten Markers zu überprüfen. In der Tat ist es in RMCE-Designs nicht ungewöhnlich, Transformationsmittel zurückzugewinnen, bei denen aufgrund der Rekombination eines einzelnen attP-Standorts eine einzelne Integration anstelle eines Austauschs stattfand9,33. Bei solchen Individuen sind sowohl fluoreszierende Marker als auch das gesamte Spenderplasmid-Rückgrat vorhanden, was die Bedeutung eines gründlichen Screenings für beide Fluoreszenzmarker unterstreicht.
Während das Vorhandensein von erwarteten Fluoreszenzmustern auf eine erfolgreiche Transformation hinweist, muss eine molekulare Charakterisierung der Insertionsstelle vorgenommen werden. Dazu ist die Erstellung genauer Karten des vorhergesagten Insertionsortes, einschließlich der flankierenden genomischen Regionen der Andocklinie, entscheidend für das Design adäquater diagnostischer Oligonukleotid-Primer für Genamplifikationsanalysen. Einzelne Integrationsereignisse führen zur Bildung von attR – und attL-Hybridstellen an der Verbindung zwischen der neu integrierten DNA und der zuvor eingefügten Kassette. Diese Websites können für die Validierung der Einfügewebsite als Ziel festgelegt werden. In RMCE-Designs kann das Einsetzen der Donorkassette in zwei alternativen Orientierungen in Bezug auf den genomischen Locus erfolgen, so dass vier Primer in alternativen PCR-Kombinationen verwendet werden können, um zu erkennen, welche Orientierung die Linie trägt. Da die Orientierung der Kassetteneinfügung die Transgenexpression beeinflussen kann, ist es bei der vergleichenden Genexpressionsanalyse wichtig, Linien mit der gleichen Ausrichtung der Insertion zu verwenden.
Bei der Arbeit mit einer geringen Anzahl von Transformationsmitteln ist es möglicherweise nicht wünschenswert, ganze Individuen für die molekulare Analyse zu opfern. Eine Option dazu ist die Durchführung einer molekularen Analyse von DNA, die aus den Beinen eines einzelnen Erwachsenen extrahiert wurde46 , da der Beinverlust die Fähigkeit eines erwachsenen Weibchens, sich zu paaren und zu ovipositieren, nicht beeinträchtigt49. Es besteht jedoch die Gefahr, dass die Person bei der Beinentfernung beschädigt wird. Der Erfolg wurde mit verworfenen Puppenfällen (L. Grigoraki persönliche Kommunikation) erzielt, aber der sicherste Ansatz besteht darin, eine molekulare Analyse an G2-Eltern durchzuführen, nachdem sie lebensfähige G3-Nachkommen erhalten haben.
In den letzten Jahren hat CRISPR/Cas9 die Art und Weise der ortsspezifischen Genom-Editierung revolutioniert26,41,50,51. Im Gegensatz zu ortsgerichtetem RMCE sind CRISPR/Cas9-vermittelte Genintegrationen (Knock-Ins) unabhängig vom Vorhandensein von vorinstallierten Rekombinationsstellen, wobei nur ein einstufiges Transformationsereignis erforderlich ist. Dennoch beruht das CRISPR/Cas9-System auf dem Vorhandensein großer bekannter genomischer Sequenzen, die die gewünschte Insertionsstelle für eine erfolgreiche homologiegerichtete Reparatur flankieren, sowie auf der effizienten Standorterkennung, die durch Leit-RNAs vermittelt wird. Diese Bedingungen können nicht immer erfüllt werden oder können mühsam zu beheben sein, und angesichts der Verfügbarkeit mehrerer Andocklinien in An. gambiae und An. stephensi und der von ihnen abgeleiteten Leitungen bleibt das φC31-System ein sehr wertvolles Werkzeug, um direkte phänotypische Vergleiche zwischen Transgenen an denselben genomischen Standorten durchzuführen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Kiona Parker (UCI) für die Bereitstellung von Bildern von transgenen An. stephensi-Larven und Fraser Colman (LSTM) und Beth Poulton (LSTM) für die Bereitstellung transgener An. gambiae-Larven . Beth Poulton (LSTM) leistete auch wertvolle Hilfe bei der Bildgebung von An. gambiae-Larven . Diese Arbeit wurde vom Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) und dem Director Catalyst Fund des LSTM finanziert, der an A.A. (DCF2014AA) vergeben wurde. A.A.J. ist Donald Bren Professor an der University of California, Irvine.
1.5 mL eppendorf tubes | |||
8-well microslides | VWR | MARI1216690 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | |||
Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm | Leica | 10446363 | |
Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm | Leica | 10447079 | |
Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII | Omega Optical | 500QM25, 500QM35 | |
Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
Petri dishes | |||
Potassium chloride | |||
Sodium Chloride | |||
Sodium phosphate dibasic | |||
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) | R1181 | |
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