概要
Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um novo modelo de infecção ativa pelo HIV usando HIV quimérico (EcoHIV), que é fundamental para melhorar nossa compreensão dos reservatórios virais do HIV-1 no cérebro e oferecer um sistema para estudar distúrbios neurocognitivos associados ao HIV e comorbidades associadas (ou seja, abuso de drogas).
Abstract
Tem sido bem estudado que o modelo de camundongo infectado pelo EcoHIV é de utilidade significativa na investigação de complicações neurológicas associadas ao HIV. O estabelecimento do modelo de ratos infectados pelo EcoHIV para estudos de abuso de drogas e distúrbios neurocognitivos seria benéfico no estudo de distúrbios neurocognitivos associados ao neurocognitivo neurocognitivo neurocognitivo (HAND) neurohiv e HIV-1. No presente estudo, demonstramos a criação bem-sucedida de um modelo de rato de infecção ativa pelo HIV usando HIV quimérico (EcoHIV). Primeiro, a construção lentiviral do EcoHIV foi embalada em células cultivadas de 293 FT por 48 horas. Em seguida, o meio condicional se concentrou e se concentrou. Em seguida, realizamos injeções estereóxicas bilaterais do EcoHIV-EGFP no tecido cerebral de rato F344/N. Uma semana após a infecção, sinais de fluorescência EGFP foram detectados no tecido cerebral infectado, indicando que o EcoHIV induz com sucesso uma infecção ativa pelo HIV em ratos. Além disso, foi realizada a imunostaining para o marcador de células microgliais, Iba1. Os resultados indicaram que a microglia era o tipo de célula predominante que abrigava o EcoHIV. Além disso, os ratos EcoHIV apresentaram alterações no processamento temporal, um potencial mecanismo neuroabportavioral subjacente da MÃO, bem como disfunção sináptica oito semanas após a infecção. Coletivamente, o presente estudo estende o modelo EcoHIV de infecção pelo HIV-1 ao rato oferecendo um valioso sistema biológico para estudar reservatórios virais do HIV-1 no cérebro, bem como comorbidades associadas à MÃO e comorbidades associadas, como o abuso de drogas.
Introduction
Os sistemas biológicos melhoraram nossa compreensão das doenças neurocognitivas associadas ao HIV-1 (HAND) e seus mecanismos neurais subjacentes2. Determinar qual sistema biológico é mais adequado para qualquer estudo, muitas vezes depende da questão do interesse2. A limitação da gama de modelos animais hospedeiros desafia os estudos sobre o desenvolvimento da doença do HIV-1. Para investigar a replicação viral e a patogênese do HIV-1, Potash et al.3 criaram um modelo de camundongo de infecção ativa pelo HIV-1, substituindo a região de codificação da glicoproteína de envelope de superfície do HIV, gp120, por gp 80 MLV ecotropic, que levou à replicação viral bem sucedida em camundongos4. Após injeções de veias na cauda em camundongos quióricos de HIV (EcoHIV), muitas características foram observadas semelhantes às de indivíduos soropositivos HIV-1 (por exemplo, linfócitos e macrófagos infectados, destinados a respostas imunes antivirais, e inflamação3,5,6).
Embora camundongos e ratos sejam ambos membros do Muridae, diferenças fundamentais de espécies podem influenciar sua adequação para questões experimentais específicas7. Portanto, a extensão do modelo de infecção do EcoHIV aos ratos (comumente utilizado em estudos de abuso de drogas e distúrbios neurocognitivos) seria vantajosa no estudo do neuroHIV. Por exemplo, seu tamanho maior torna a implantação do cateter jugular para procedimentos de autoadministração de medicamentos mais práticos8. Técnicas de autoadministração de medicamentos em ratos têm sidoutilizadas para avaliar a motivação no HIV-19 . Além disso, muitas tarefas neurocognitivas/comportamentais foram inicialmente projetadas para ratos10. Aqui, relatamos a utilização de injeções estereotribuíficas de EcoHIV em ratos para ampliar o modelo de infecção do EcoHIV e dar uma oportunidade fundamental para abordar novas questões relacionadas ao neuroHIV e à MÃO.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, estabelecemos um modelo de infecção por HIV induzida pelo EcoHIV em ratos. Especificamente, descrevemos uma injeção estereotaxa bilateral de EcoHIV no córtex que induziu com sucesso a infecção ativa do HIV no cérebro de rato 7 dias após a injeção. Futhermore, demonstramos que a infecção pelo EcoHIV em ratos pode ser um bom sistema biológico para estudar aspectos-chave da MÃO. Oito semanas após a infecção pelo EcoHIV, os ratos apresentaram prejuízos neurocognitivos significativos, que i…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624.
Materials
| 293FT cells | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap | Life Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Life Technologies | 10013CV | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| drill | |||
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes | Life Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 1701 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technologies | L3000015 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf Instruments | Model 900 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
参考文献
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