Trapianto di macrofagi cardiaci di topo neonatale in topi adulti

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per l’uso e la cura degli animali da laboratorio. Tutti i protocolli animali sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), dal Fuwai Hospital, dall’Accademia cinese delle scienze mediche. La tecnica asettica è necessaria durante tutta la procedura per prevenire la contaminazione del sito chirurgico. 1. Operazione di resezione apicale in topo neonatale Cx3cr1 GFP/+ di 1 giorno (backgroundC57BL/6) Anestesia Prendi tutti i cuccioli di topo dalle gabbie e mettili in una scatola asciutta e pulita. Incorporare ogni mouse nel ghiaccio per circa 2-3 minuti. Assicurarsi che ci sia una barriera sottile come il lattice o una garza tra il ghiaccio e il cucciolo di topo per prevenire il congelamento. Identifica un’anestesia sufficiente osservando i seguenti segni: pelle pallida, mancanza di movimento degli arti e mancanza di riflesso del pedale. Thoracotomy Preraffreddare la piattaforma operativa in bronzo durante la notte a -20 °C per aiutare a mantenere l’anestesia. Prendi il mouse anestetizzato dalla ghiacciaia e mettilo su una piattaforma operativa in bronzo. Ancorare il mouse sulla piattaforma operativa in posizione supina utilizzando nastro adesivo medico. Metti la piattaforma operativa con il mouse su di essa sotto uno stereoscopio. Disinfettare il torace del topo utilizzando un pad di preparazione imbevuto di betadine e alcol al 70% o in linea con la politica istituzionale. Incidere la pelle con un taglio di 1 cm nella quarta area intercostale della cavità toracica e quindi separare i muscoli intercostali usando forbici microchirurgiche fino ad accedere al cuore. In alternativa, premere il torace e l’addome con l’aiuto di due pinza fino a quando il cuore non è esteriorizzato dal torace senza alcun danno meccanico. Impostare le costole sotto e sopra la piccola incisione come una fissazione naturale per immobilizzare il cuore. Resezione dell’apice ventricolare Individuare l’apice del ventricolo sinistro. Tagliare un diametro di 1 mm di tessuto apicale ventricolare usando le forbici per iridectomia sotto uno stereoscopio. Confermare che la camera ventricolare sinistra sia esposta e iniziare a trasudare. Premere delicatamente il cuore nella cavità toracica usando un batuffolo di cotone. Suturare i muscoli, le costole e la pelle usando 8-0 Suture di prolene. Pulire accuratamente il mouse dopo l’operazione. Assistenza post-operatoria Trasferire il mouse dalla piattaforma operativa a una coperta riscaldante a 37 °C per riscaldare il corpo immediatamente dopo l’operazione. Confermare l’anabiosi del topo osservando i seguenti segni: ripristino spontaneo della respirazione, cambiamento del colore della pelle da pallido a rosa e movimento degli arti. Riporta il mouse operato a sua madre una volta che si è ripreso. Mescolare il mouse operato con i materiali di nidificazione della madre, se necessario.NOTA: È importante rimuovere tutti i cuccioli di 1 giorno dalla madre contemporaneamente e quindi restituirli tutti in una volta dopo che tutti i cuccioli sono stati recuperati. 2. Preparazione della sospensione del macrofago cardiaco neonatale NOTA: Tutte queste procedure sperimentali devono essere eseguite in un luogo buio e in condizioni sterili. Raccogli il cuore di un topo neonatale Cx3cr1GFP/+ 1 giorno dopo la resezione apicale Eutanasia del mouse Cx3cr1GFP/+ un giorno dopo la resezione apicale. Utilizzare un eccesso di anidride carbonica e decapitare il topo in sequenza per applicare l’eutanasia. Togli il cuore dal petto e immergilo in un piatto da 10 cm con PBS. Tagliare i vasi e il tessuto connettivo rimanente lontano dai ventricoli. Tagliare l’appendice auricolare e il tratto di deflusso lontano dal cuore. Dopo che il cuore smette di battere, tagliare il cuore in 1-2 mm3 pezzi nel tampone PBS usando forbici microchirurgiche (Figura 2A). Dissociazione cardiaca neonatale del topo Trasferire il tessuto cardiaco raccolto in un tubo contenente 2,5 ml di miscela enzimatica preriscaldata (Tabella dei materiali) e chiudere ermeticamente il tubo. Invertire il tubo e posizionarlo con il cappuccio verso il basso (Figura 2B). Eseguire il programma di dissociazione del cuore neonatale (Tabella dei materiali). Staccare il tubo dal dissociatore dopo che il programma è stato completato. Aggiungere 7,5 ml di 1x DMEM con il 10% fbS al tubo. Filtrare e trasferire la sospensione in un tubo centrifuga da 15 mL (Figura 2C). Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti. Risuspenare il pellet cellulare in 1 mL di soluzione di lisi delle cellule del sangue e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 5-10 ml di tampone PBS alla sospensione e centrifugare a 300 x g per 5 minuti. Rispendare il pellet cellulare in 1 mL di DMEM con il 10% di FBS. Isolamento dei macrofagi cardiaci neonatali Ordina GFP+ macrofagi cardiaci neonatali di FACS. Ricevi i macrofagi ordinati in un tubo sterile contenente 500 μL di DMEM con il 10% di FBS. Contare i macrofagi GFP+ (Figura 2D). Sospendare il macrofago in DMEM con 10% FBS alla concentrazione di 1 x 106 macrofagi per 200 μL di DMEM per successiva iniezione.NOTA: Il numero di macrofagi GFP+ è piccolo in un neonato (circa 1 x 105); pertanto, almeno 10 neonati devono essere utilizzati per ottenere un numero sufficiente di macrofagi per ogni iniezione di topo adulto. 3. Trapianto di macrofagi cardiaci neonatali Eseguire un’operazione di infarto miocardico su un topo C57BL/6 maschio adulto (6-8 settimane) maschio legando l’arteria coronaria anteriore sinistra8. Mettere il mouse operato su una coperta riscaldata a 37 °C fino a quando non si riprende. Iniettare per via endovenosa 200 μL di DMEM con 1 x 106 GFP+ macrofagi cardiaci neonatali nel topo adulto infartato dopo l’operazione (circa 6 ore dopo) attraverso la vena della coda. Rimanda il mouse in una gabbia pulita. 4. Valutazione dei risultati Convalida dell’efficienza di iniezione Anestetizzare il topo operato e raccogliere il cuore 7 giorni dopo l’operazione di infarto miocardico. Immergere il cuore nel buffer PBS pre-raffreddato. Fissare il tessuto cardiaco con il 4% di poliformaldeide per 72 ore a temperatura ambiente con agitazione. Disidratare il tessuto cardiaco in dimetilbenzene ed etanolo. Incorporare il tessuto cardiaco nella paraffina e tagliarlo in sezioni con uno spessore di 5 μm. Eseguire il protocollo standard di colorazione dell’immunofluorescenza1. Utilizzare α-actinina per marcare i cardiomiociti. Rileva i macrofagi GFP+ nel cuore che riceve il trapianto. Eseguire il protocollo standard di colorazione dell’immunofluorescenza1. Utilizzare α-actinina e pH3 per marcare rispettivamente i cardiomiociti e la proliferazione cellulare (Figura 3A). Valutazione della riparazione cardiaca dopo il trapianto Utilizzare l’ecocardiografia sul mouse operato un mese dopol’operazione 1. Analizzare la funzione cardiaca confrontando la frazione di eiezione ventricolare sinistra e l’accorciamento frazionario in diversi gruppi (Figura 3B). Anestetizzare il topo operato e raccogliere il cuore. Ripetere i passaggi 4.1.2-4.1.5. Eseguire un protocollo di colorazione di Masson. Analizzare l’area infartata dopo l’iniezione di macrofagi (Figura 3C).