Generación Y Ensamblaje De Nucleocápsides Específicas Del Virus Respiratorio Sincitial

Los virus de ARN de sentido negativo no segmentado (NNS) incluyen muchos patógenos humanos significativos, como la rabia, el ébola y el virus sincitial respiratorio (RSV)^1,2. El RSV es la principal causa de enfermedades respiratorias como la bronquiolitis y la neumonía en niños pequeños y adultos mayores en todo el mundo³. Actualmente, no hay vacunas efectivas o terapias antivirales disponibles para prevenir o tratar el RSV^4. Como parte del ciclo de vida, el genoma del RSV sirve como la plantilla para la replicación por la ARN polimerasa dependiente del ARN del RSV para producir un antigenoma, que a su vez actúa como la plantilla para generar un genoma de progenie. Tanto el genoma como el antigenoma RNAs son totalmente encapsidados por la nucleoproteína (N) para formar las nucleocápsides (NCs)³. Debido a que los CN sirven como plantillas tanto para la replicación como para la transcripción por la ARSV polimerasa, el ensamblaje adecuado de NC es crucial para que la polimerasa obtenga acceso a las plantillas para la síntesis de ARN^5. Curiosamente, basándose en los análisis estructurales de las polimerasas virales NNS, se presume que varias proteínas N se disocian transitoriamente de las NCs para permitir el acceso de la polimerasa y reenlazarse al ARN después de la síntesis de ARN^{6,7,8,9,10,11,12.}

Actualmente, el ensayo de polimerización de ARN del RSV se ha establecido utilizando la polimerasa purificada del RSV en plantillas cortas de ARN desnudo^13,14. Sin embargo, las actividades de la RSV polimerasa no alcanzan el óptimo, como se observa en los productos no procesivos y abortivos generados por la RSV polimerasa cuando se utilizan plantillas de ARN desnudo. La carencia del NC con el ARN virus-específico es una barrera primaria para la comprensión mecanicista adicional de la síntesis del ARN de RSV. Por lo tanto, el uso de una plantilla de ARN auténtica se convierte en una necesidad crítica para avanzar en el conocimiento fundamental de la síntesis de ARN del RSV. Las estructuras conocidas de las partículas similares a nucleocáps (NCLPs) del RSV y otros virus de ARN del NNS revelan que los ARN en los NCLPs son ARN celulares aleatorios o ARN genómicos virales promedio^{15,16,17,18,19.} Juntos, el principal obstáculo es que N se une no específicamente a los RNAs celulares para formar NCLPs cuando N se sobreexpresa en las células huésped.

Para superar este obstáculo, establecimos un protocolo para obtener primero RNA-libre (N⁰⁾y ensamblar N⁰ con ARN genómico viral auténtico en NCLPs^20. El principio de este protocolo es obtener una gran cantidad de N libre de ARN recombinante (N⁰⁾coexpresando N con una chaperona, el dominio N-terminal de la fosfoproteína del VSR (P_NTD). El N⁰P purificado podría ser estimulado y ensamblado en NCLPs mediante la adición de oligos de ARN específicos del RSV, y durante el proceso de ensamblaje, la chaperona P_NTD se desplaza tras la adición de oligos de ARN.

Aquí, detallamos un protocolo para la generación y el montaje de RSV ARN-específico NCs. En este protocolo, se describe la clonación molecular, la preparación de proteínas, el ensamblaje in vitro y la validación del ensamblaje complejo. Destacamos la estrategia de clonación para generar construcciones bi-cistrónicas para la coexpresión de proteínas para la clonación molecular. Para la preparación de proteínas, se describen los procedimientos de cultivo celular, extracción de proteínas, y la purificación del complejo proteico. A continuación, discutimos el método para el montaje in vitro de los NCs específicos de ARN del RSV. Finalmente, utilizamos la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y la microscopía electrónica de manchas negativas (EM) para caracterizar y visualizar los NCLPs ensamblados.