Целью этого протокола является предоставление подробных рекомендаций по подготовке образцов при планировании экспериментов с использованием MALDI MSI для максимального метаболического и молекулярного обнаружения в биологических образцах.
Метаболомика, исследование для выявления и количественной оценки малых молекул и метаболитов, присутствующих в экспериментальном образце, стало важным инструментом для исследования биологической активности во время развития и заболеваний. Метаболомические подходы широко используются в изучении рака, питания / диеты, диабета и других физиологических и патологических состояний, связанных с метаболическими процессами. Удовлетворительным инструментом, который помогает в метаболомическом профилировании, пропагандируемом в этой статье, является матричная лазерная десорбция / ионизация масс-спектрометрической визуализации (MALDI MSI). Его способность обнаруживать метаболиты in situ без маркировки, структурных модификаций или других специализированных реагентов, таких как те, которые используются в иммуноокрашивающих средствах, делает MALDI MSI уникальным инструментом в продвижении методологий, актуальных в области метаболомики. Соответствующий процесс подготовки образцов имеет решающее значение для получения оптимальных результатов и будет в центре внимания настоящего документа.
Метаболиты, промежуточные продукты или конечные продукты метаболизма, включая нуклеотиды, амино- или органические кислоты, липиды, являются ключевыми компонентами биологических функций и процессов. Метаболомика, изучение метаболитов, позволяет исследовать их биохимические взаимодействия и понимать их роли в контексте фундаментальных, трансляционных и клинических исследований. Метаболиты тесно связаны с фенотипами организмов и предоставляют информацию о биохимической активности, которая происходит во время клеточногометаболизма1. Поэтому, помимо геномики и протеомики, метаболомика стала важным инструментом в понимании как физиологических, так и патологических состояний. Например, метаболомика используется для выяснения механизмов, лежащих в основе существующих лекарств, а также их переносимости. При разработке лекарств ксенобиотический метаболизм полезен для оценки активности или токсичности метаболитов между видами, что позже переводится в поддержку персонализированной медицины2. Несмотря на широкое применение метаболомики, визуализация метаболитов может быть сложной задачей из-за химической реакционной способности метаболитов, структурной неоднородности и широкого диапазона концентраций3. Однако концентрации лабильных метаболитов, включая высокоэнергетические соединения, глюкозу, лактат, гликолитические, пентозные шунтовые пути и промежуточные продукты цикла ТЦА, фосфолипиды, нейротрансмиттеры, сигнальные соединения, могут изменяться в течение секунд и прогрессировать в течение нескольких минут, когда тканевые ферменты активны во время процедур сбора тканей, таких как посмертная ишемия при сборе мозга4,5,6 . Для обеспечения точного сбора метаболомных данных решающее значение имеет надлежащая и тщательная пробоподготовка7,8. Современные платформы для измерения метаболитов включают ЯМР, ферментные анализы и масс-спектрометрию (включая жидкостную и газовую хроматографию), последняя из которых обсуждается ниже.
MALDI-MSI – это современный метод, который позволяет анализировать сложные образцы путем обнаружения отдельных молекулярных видов. MALDI MSI дает преимущество возможности быстрого и воспроизводимого измерения различных молекулярных соединений в биологических образцах. Масс-спектрометрическая визуализация дополнительно позволяет получать изображения, которые представляют биологию ткани на основе ее составных метаболитов, и делает это при сохранении пространственного распределения метаболитов в образце9. Способность MALDI обнаруживать аналиты в образце без использования маркировки антител, структурных модификаций или других специализированных реагентов, таких как те, которые используются в иммуноокрашивающих веществах, в сочетании с его способностью контролировать сотни молекул в рамках одного эксперимента, составляют лишь некоторые из преимуществ визуализации РС, когда речь идет о метаболическом профилировании10, 11. В дополнение к широко используемым матрицам, таким как 2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB) и 9-аминоакридин (9-AA), недавно обнаруженная новая матрица N-(1-нафтил) этилендиамина дигидрохлорид (NEDC), которая хорошо подходит для анализа различных низкомолекулярных метаболитов, еще больше улучшила применение MALDI MSI в метаболическом профилировании12.
Несмотря на широкое применение MALDI MSI, высокая стоимость прибора и сложность экспериментальной процедуры препятствует его более широкому внедрению в отдельных исследовательских лабораториях. Поэтому большинство исследований MALDI MSI поддерживаются через общие основные средства. Подготовка образцов, включая подготовку слайдов и покрытие матрицы, является наиболее важным этапом в MALDI MSI. Тем не менее, подготовка слайдов обычно проводится в лаборатории отдельного исследователя, что создает потенциальные вариации в последующем приобретении MALDI MSI. Здесь мы стремимся предоставить подробный протокол для пробоподготовки биологических образцов, прежде чем приступать к измерениям MALDI MSI, и использовать метаболомическое профилирование мозга мыши развития в качестве примера.
MALDI-Imaging (MALDI-MSI) – это метод визуализации без меток, который позволяет исследователям исследовать распределение различных биомолекул и их модификаций в тканях, молекулярную основу патологии. Совместное использование MALDI-MSI с традиционными подходами LC-MS для анализа тканей обеспечивает ту же молекулярную глубину, что и традиционные рабочие процессы Omics, но также сохраняет пространственную связь этих сигналов в клеточной сети. Пробоподготовка является наиболее важным этапом в MALDI MSI и учитывает вариации в окончательных показаниях метаболомических исследований, проведенных в разных лабораториях4. Здесь мы предоставляем всеобъемлющий, но практический протокол для стандартизации подготовки образцов для метаболомного профилирования с использованием MALDI MSI в надежде, что это принесет пользу широкому исследовательскому сообществу для внедрения MALDI MSI в их текущих и будущих исследованиях от фундаментальной биологии до трансляционных исследований.
Необходимо всегда помнить обо всех мерах предосторожности, чтобы свести к минимуму изменения в молекулярных профилях (как в изобилии, так и в пространственном распределении) во время подготовки образцов и избежать загрязнения. Во-первых, минимизируйте время между эвтаназией животных и сбором тканей, таких как замораживание in situ или нагревание микроволновой фиксацией для инактивации ферментов в мозге, чтобы уменьшить ответственность за посмертную ишемию4,5,6. Во-вторых, состояние мгновенного замораживания образца является критическим. Недостаточное замораживание приведет к деградации и потере метаболитов, в то время как чрезмерное замораживание приведет к фрагментации тканей во время криосекции. Время замораживания всегда должно быть проверено в первую очередь в соответствии с предыдущими исследованиями, а исследование мозга мыши, представленное в этой статье, обеспечивает ориентиры для мозговой ткани грызунов. В-третьих, разрезание биологических тканей и перенос их участков на слайды МТО потребует адекватной практики. Важно отметить, что при использовании кисти для подъема участка со сцены кисть следует использовать деликатно. Позвольте щетинкам щетки соприкасаться только с краями участка ткани, чтобы снизить риск загрязнения и фрагментации сечения. Максимально сглажьте срез на слайде, это предотвратит скручивание секции во время разогрева пальцев. В-четвертых, при монтаже на слайд ITO убедитесь, что вся секция хорошо прикреплена к слайду ITO, так как разные области ткани могут потребовать разного времени нагрева пальцев. Например, опухолевая ткань головного мозга требует более длительного времени нагрева, чем нормальная ткань мозга. Плохое крепление может привести к отслоению и фрагментации ткани во время сканирования MALDI-MS. Имейте в виду, что согревание пальцев может обеспечить действие ферментов и метаболизм, вызывающих артефактные изменения метаболитов. В-пятых, тонкое и равномерное осаждение матрицы MALDI играет важную роль в получении точной пространственной информации и сильного сигнала MALDI-MS. Рекомендуется протестировать напыление матрицы на пустом слайде и наблюдать за кристаллическим рисунком под микроскопом, чтобы убедиться в правильном покрытии, прежде чем приступать к покрытию драгоценного образца слайда. И, наконец, поскольку отдельный исследователь выполняет сбор ткани и подготовку слайдов с разной скоростью, было бы идеально иметь одного человека для обработки образца для образца в одной и той же когорте, чтобы свести к минимуму вариации.
В приведенном выше протоколе подробно описываются стандартные процедуры, которые могут быть адаптированы к потребностям конкретных экспериментов. Например, криосекционный гель OCT, который обычно используется при криосекредении образца, может быть дополнительно использован в качестве монтажного клея к тканевому патрону (как в исследовании, описанном выше). Предыдущие исследования показали, что полимерный компонент в ОКТ вызывает сильное подавление ионов14. Однако встраивание образца может быть неизбежным в тех случаях, когда ткань слишком хрупкая, чтобы ее можно было разрезать без дополнительной поддержки полимерного геля. Для борьбы с подавлением сигнала в этих случаях ткани может потребоваться промывка при последовательной промывке 70% этанола и 95% этанола для удаления остаточного ОКТ для обнаружения белков или липидов, в то время как промывка не рекомендуется для обнаружения малых молекулярных метаболитов9.
MALDI MSI становится все более актуальным как в исследовательской лаборатории, так и в клинической практике. Например, MALDI MSI недавно оказался полезным в исследованиях протеомики для характеристики фенотипического функционального статуса организма15и в качестве агента для микробной идентификации и диагностики последующего заболевания16. Хотя MALDI MSI поддерживает широкий спектр применений, существуют некоторые ограничения, связанные с опорой исключительно на этот метод, особенно когда речь идет о дифференциации между аналогичными видами или метаболитами и идентификации конкретных мишеней. Другой проблемой является количественная оценка концентрации метаболитов в соответствии с сигналами MALDI MSI. Часто предполагается, что обилие ионов в спектрах MALDI MSI и пространственное распределение (или относительное изобилие) соответствующих молекулярных видов в рассеченных тканях хорошо коррелируют. Однако всегда следует иметь в виду, что связь между интенсивностью ионов и количеством соответствующих молекулярных видов осложняется многочисленными факторами, включая, но не ограничиваясь, эффектами подавления ионов, изменениями структуры тканей и ионно-молекулярными реакциями17. Методы, использующие внутренние стандарты, могут быть реализованы для абсолютной количественной оценки (мкмоль/г ткани) в MALDI-MSI18. Эти две проблемы обычно решаются с помощью комбинированного рабочего процесса MALDI MSI с методами жидкостной хроматографии тандема MS (LC-MS / MS), в соответствии с которым MALDI-MS позволяет отображать интересующую область, которая впоследствии подвергается микроэкстракции и LC-MS / MS для предоставления дополнительной информации для идентификации метаболита19.
Методы визуализации на основе РС были разработаны в последние годы в качестве альтернативы предыдущим методам визуализации метаболитов малых молекул. С развитием и растущей популярностью MALDI MSI ожидается, что визуализация MALDI станет новым стандартным инструментом для визуализации малых молекул. Особый интерес представляют визуализация липидных и эндогенных малых молекул (например, нейротрансмиттеров и метаболитов) в биологическом контексте, а также визуализация ксенобиотиков для разработки новых фармацевтических агентов. Ожидается, что в ближайших20годах эти три области будут быстро прогрессировать с применением MALDI MSI.
The authors have nothing to disclose.
Ye He и Ринат Абзалимов поддерживаются Программой научных премий Конгресса профессиональных сотрудников Городского университета Нью-Йорка (PSC-CUNY). Юки Чен и Келли Вирасамми поддерживаются Летней исследовательской программой бакалавриата Фонда Альфреда. Слоуна CUNY.
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
Autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) | Millipore Sigma Aldrich | 222488 | |
SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |