このプロトコルの目的は、生物学的サンプル中の代謝および分子検出を最大化するためにMALDI MSIを使用した実験を計画する際のサンプル調製に関する詳細なガイダンスを提供することです。
実験サンプルに存在する小分子や代謝産物を同定・定量化する研究であるメタボロミクスは、開発中および疾患の生物学的活動を調査する重要なツールとして浮上している。メタボロミクスのアプローチは、癌、栄養/食事、糖尿病、および代謝過程を含む他の生理学的および病理学的状態の研究に広く採用されている。本論文で提唱されたメタボロミックプロファイリングを支援する有利なツールは、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析イメージング(MALDI MSI)です。標識、構造修飾、または免疫染色に使用されるような他の特殊な試薬を含まない現場で代謝産物を検出する能力により、MALDI MSIはメタボロミクスの分野に関連する方法論を進めるユニークなツールとなります。最適な結果を得るには、適切なサンプル調製プロセスが不可欠であり、このホワイト ペーパーの焦点となります。
代謝産物は、代謝産物の中間体または代謝の産物、ヌクレオチド、アミノ酸または有機酸、脂質、生物学的機能およびプロセスの重要な構成要素である。代謝産物の研究であるメタボロミクスは、基礎、翻訳、および臨床研究の文脈における生化学的相互作用の探求と役割の理解を可能にする。代謝産物は、生物のフェノタイプと強く関連しており、細胞代謝中に生じる生化学的活動に関する情報を提供する1。したがって、ゲノミクスやプロテオミクスに加えて、メタボロミクスは生理学的および病理学的状態の両方を理解する上で重要なツールとして登場しました。例えば、メタボロミクスは、既存の薬剤の背後にあるメカニズムとその耐性を解明するために使用されます。医薬品開発において、異種代謝は、種を越えた代謝産物の活性または毒性を評価するのに有用であり、後に個別化医療2を支援することに変換される。メタボロミクスの広範な適用にもかかわらず、代謝産物のイメージングは、代謝産物の化学的反応性、構造不均一性、および広い濃度範囲3のために困難であり得る。しかし、高エネルギー化合物、グルコース、乳酸、解糖、ペントースシャント経路、およびTCAサイクル中間体を含む不安定代謝産物の濃度は、リン脂質、神経伝達物質、シグナル伝達化合物、組織酵素が死後のイシュ血症の収穫手順中に活動する数秒以内に変化し、数分で進行する可能性がある。.正確なメタボロミクスデータ取得を確実にするために、適切かつ慎重なサンプル調製は7、8を極めて重要である。代謝産物を測定するための現在確立されたプラットフォームには、NMR、酵素アッセイ、質量分析(液体およびガスクロマトグラフィーを含む)があり、最後の点を以下に説明する。
MALDI-MSIは、個々の分子種の検出を通じて複雑なサンプルの分析を可能にする最先端の技術です。MALDI MSIは、生物学的試料中の様々な分子化合物を迅速かつ再現的に測定することができるという利点を与えます。質量分析イメージングは、さらに、その複合代謝産物に基づいて組織生物学を表す画像の生成を可能にし、また、サンプル9中の代謝産物の空間分布を維持しながらそれを行う。MALDIは、抗体標識、構造修飾、または免疫染色に使用されるような他の特殊な試薬を使用せずにサンプル中の検体を検出する能力と、単一の実験内で何百もの分子を監視する能力と相まって、MSイメージングが代謝プロファイリングに与える利点のほんの一部を含む10、 11.2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)や9-アミノアクリジン(9-AA)などの一般的に使用されるマトリックスに加えて、最近発見された新しいマトリックスN-(1-Naphthyl) エチレンジロイクロ塩化 (NEDC) は、様々な低分子量代謝物の分析に適しており、MS2.
MALDI MSIの広範な適用にもかかわらず、装置の高いコストおよび実験手順の複雑さは、個々の研究所でのより広い実装を防ぐ。したがって、MALDI MSI研究の大部分は、共有コア施設を通じてサポートされています。スライド調製およびマトリックスコーティングを含むサンプル調製は、MALDI MSIにおける最も重要なステップです。しかし、スライドの準備は通常、個々の研究者の研究室で行われ、後のMALDI MSI取得に潜在的なバリエーションを生み出します。ここでは、MALDI MSI測定に進む前に生体試料のサンプル調製のための詳細なプロトコルを提供し、発達マウス脳のメタボロミックプロファイリングを例として用いることを目指しています。
MALDIイメージング(MALDI-MSI)は、研究者が様々な生体分子の分布と組織の修飾、病理学の分子ベースを調査することを可能にするラベルフリーイメージング技術です。MALDI-MSIと従来のLC-MSアプローチを組織分析に組み合わせることで、従来のオミックスワークフローと同じ分子深度を提供しますが、セルラーネットワーク内でのそれらの信号の空間的関係も保持します。サンプル調製は、MALDI MSIの中で最も重要なステップであり、異なるラボ4で行われたメタボロミクス研究の最終的な読み出しの変動を説明する。ここでは、MALDI MSIを用いたメタボロミクスプロファイリングのサンプル調製を標準化するための包括的かつ実用的なプロトコルを提供し、基礎生物学から翻訳研究までの現在および将来の研究にMALDI MSIを実施するために広範な研究コミュニティに利益をもたらすことを期待しています。
サンプル調製中の分子プロファイル(豊富度と空間分布の両方)の変化を最小限に抑え、汚染を避けるためには、常にすべての予防措置を念頭に置く必要があります。まず、動物安楽死と組織収穫の間の時間を最小限に抑え、例えば、その際に凍結するか、または脳内の酵素を不活性化するためにマイクロ波固定によって加熱して、死後の虚血4、5、6への責任を軽減する。第二に、サンプルのスナップ凍結状態は重要です。不十分な凍結は代謝物の分解および喪失を引き起こし、凍結を超えて凍結は凍結切断中に組織の断片化を引き起こす。凍結時間は、以前に報告された研究によると、常に最初にテストされるべきであり、この論文で提示された発達マウス脳の研究は、げっ歯類の脳組織の基準点を提供する。第三に、生体組織の切断とITOスライドへの切片の転送には、十分な実践が必要である。ブラシを使ってステージから断面を拾う際は、ブラシを繊細に使用する必要があります。ブラシの毛が組織セクションの端と接触するだけで汚染やセクションの断片化のリスクを減らします。スライド上のセクションを可能な限り平らにし、指の温暖化中にセクションのカールを防止します。第四に、ITOスライドに取り付けながら、組織の異なる領域が指の温暖化の異なる時間を必要とするかもしれないので、セクション全体がITOスライドに十分に取り付けられていることを確認してください。例えば、脳腫瘍組織は、正常な脳組織よりも長い温暖化時間を必要とする。マウントが悪いと、MALDI-MS スキャン中に組織が剥離し、断片化する可能性があります。指の温暖化は、代謝産物の実際の変化を引き起こす酵素作用および代謝を可能にする可能性があることを覚えておいてください。第5に、MALDIマトリックスの微細で均一な堆積は、正確な空間情報と強いMALDI-MS信号を達成する上で重要な役割を果たします。それは、空のスライドにマトリックス噴霧をテストし、貴重な標本スライドのコーティングに進む前に、適切なカバレッジを確認するために顕微鏡で結晶パターンを観察することをお勧めします。そして最後に、個々の研究者が組織の収穫とスライドの準備を異なる速度で実行するので、同じコホート内の標本のサンプル調製を処理する人を1人持って、変動を最小限に抑えることが理想的であろう。
上記のプロトコルは、特定の実験のニーズに合わせて調整することができる標準的な手順を詳述しています。例えば、通常、試料のクライオ切片に使用される凍結切片ゲルOCTは、組織チャックへの取り付け用接着剤としてさらに利用することができる(上記の研究で述べた研究のように)。以前の研究では、OCTのポリマー成分が強いイオン抑制14を引き起こすことが示されている。しかし、ポリマーゲルからの追加の支持なしに組織が壊れやすすぎて切断できない場合には、サンプルを埋め込むのは避けられない場合があります。これらの場合のシグナル抑制に対抗するためには、組織は、タンパク質または脂質の検出のために残留OCTを除去するために70%エタノールおよび95%エタノールで連続洗浄で洗浄する必要があるが、洗浄は小分子代謝産物9の検出には推奨されない。
MALDI MSIは、研究室と臨床現場の両方でますます関連性が高まっています。例えば、MALDI MSIは、最近、生物15の表現型機能状態を特徴付けるためにプロテオミクスの研究に有用であることが証明されており、その後の疾患16の微生物同定および診断のための薬剤として作用する。MALDI MSIは幅広い用途をサポートしていますが、特に類似種または代謝物の区別や特定の標的の同定に関しては、この技術だけに依存することに関連するいくつかの制限があります。もう一つの課題は、MALDI MSI信号に従った代謝物濃度の定量化である。MALDI MSIスペクトルのイオンの存在量と、解剖された組織全体の対応する分子種の空間分布(または相対的な存在量)は、よく相関していると考えられます。しかし、イオン強度と対応する分子種の量との関係は、イオン抑制の効果、組織構造およびイオン分子反応17を含む多数の要因によって複雑であることを常に念頭に置くべきである。MALDI-MSI18では、絶対定量(μmol/g組織)に対して内部標準を利用した技術を実装できます。これらの 2 つの課題は、MALDI MSI と液体クロマトグラフィーのタンデム MS(LC-MS/MS) 技術を組み合わせたワークフローで対処され、MALDI-MS は関心領域のマッピングを可能にし、後にマイクロ抽出と LC-MS/MS を適用して代謝物19を識別するためのより多くの情報を提供します。
MSベースのイメージング法は、近年、小分子代謝物をイメージングするための以前の手法に代わる方法として開発されています。MALDI MSIの進歩と人気の高まりに伴い、MALDIイメージングは、低分子を可視化するための新しい標準ツールになることが期待されています。生物学的文脈における脂質および内因性の小分子(例えば神経伝達物質および代謝産物)のイメージング、ならびに新しい医薬開発のための異種生物剤のイメージングは特に興味深い。これら3つの分野は、近い将来MALDI MSIの適用と急速な進歩を遂げるために20.
The authors have nothing to disclose.
Ye HeとRinatアブザリモフは、ニューヨーク市立大学プロフェッショナルスタッフコングレス(PSC-CUNY)研究賞プログラムの支援を受けています。ユキ・チェンとケリー・ヴィーラサミーは、アルフレッド・P・スローン財団CUNYサマー学部研究プログラムの支援を受けています。
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
Autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) | Millipore Sigma Aldrich | 222488 | |
SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |