本协议的目标是在规划使用 MALDI MSI 进行实验时,为样品制备提供详细的指导,以最大限度地提高生物样品中的代谢和分子检测。
代谢学是识别和量化实验样本中小分子和代谢物的研究,已成为研究发育过程中的生物活动和疾病的重要工具。代谢学方法被广泛应用于癌症、营养/饮食、糖尿病和其他涉及代谢过程的生理和病理条件的研究。本文所提倡的有助于代谢分析的有利工具是矩阵辅助激光脱光/电离子质谱成像(MALDI MSI)。它能够在不标记、结构修改或其他特殊试剂(如用于免疫染色)的情况下就地检测代谢物,使 MALDI MSI 成为推进代谢学领域相关方法的独特工具。适当的样品制备过程对于产生最佳结果至关重要,并且将成为本文的重点。
代谢物,代谢的中间体或最终产物,包括核苷酸、氨基酸或有机酸、脂质,是生物功能和过程的关键成分。代谢学,代谢物的研究,允许探索其生化相互作用,并理解其在基础、转化和临床研究中的作用。代谢物与生物体的表型密切相关,并提供细胞代谢过程中发生的生化活动信息。因此,除了基因组学和益生术之外,代谢学已成为了解生理和病理条件的重要工具。例如,代谢学用于阐明现有药物背后的机制及其耐受性。在药物开发中,异生物代谢有助于评估不同物种代谢物的活动或毒性,后来转化为支持个性化药物2。尽管代谢学的广泛应用,代谢物的成像可能具有挑战性,由于代谢物的化学反应性,结构异质性和广泛的浓度范围3。然而,包括高能化合物、葡萄糖、乳酸盐、糖溶胶、五氯蔗分流通路和TCA循环中间体、磷脂、神经递质、信号化合物在内的阴唇代谢物的浓度,在组织酶在组织采集过程中活跃时,如脑收获4、5、6中的死后缺血,可在几秒钟内发生变化,并在几分钟内取得进展.为确保准确的代谢数据采集,适当和仔细的样品准备是关键7,8。目前已建立的测量代谢物的平台包括NMR、酶检测和质谱(包括液体和气体色谱),最后一个平台在下面进一步讨论。
MALDI-MSI 是一种最先进的技术,它允许通过检测单个分子物种来分析复杂的样品。MALDI MSI 使能够快速和可重复地测量生物样本中的各种分子化合物的好处。质谱成像进一步允许产生基于其复合代谢物的表示组织生物学的图像,同时保留样品9中代谢物的空间分布。MALDI 能够在不使用抗体标记、结构修饰或其他专用试剂(如用于免疫染色)的情况下检测样品中的分析物,再加上它在单个实验中监测数百个分子的能力,仅包括 MS 成像在代谢分析10方面授予的一些优势, 11.除了常用的基质,如2,5-二氢苯二甲酸(DHB)和9-阿米诺阿克里丁(9-AA),最近发现了新的基质N-(1-纳芙yl)二氢二氢化二氢(NEDC),这是非常适合分析各种低分子量代谢物, 进一步改善了马尔迪MSI在代谢分析12中的应用。
尽管MALDI MSI的广泛应用,但仪器的高成本和实验程序的复杂性阻碍了其在个别研究实验室的广泛实施。因此,大多数 MALDI MSI 研究都通过共享的核心设施提供支持。样品制备,包括幻灯片制备和矩阵涂层,是 MALDI MSI 中最关键的一步。但是,幻灯片制备通常在个别研究人员的实验室进行,这为以后的 MALDI MSI 收购带来了潜在的变化。在这里,我们旨在提供一个详细的协议,为生物样本的样品准备之前,进行MALDI MSI测量,并使用发育小鼠大脑的代谢分析作为例子。
MALDI-成像(MALDI-MSI)是一种无标签的成像技术,使研究人员能够研究各种生物分子的分布及其在组织中的修饰,这是病理学的分子基础。将 MALDI-MSI 与传统的 LC-MS 组织分析方法相结合,提供与传统 Omics 工作流相同的分子深度,但也保留了细胞网络中这些信号的空间关系。样本制备是 MALDI MSI 中最关键的一步,也是在不同实验室进行的代谢学研究的最终读出中变化的原因。在这里,我们提供了一个全面而实用的协议,以标准化使用 MALDI MSI 进行代谢分析的样本准备,希望它有利于广泛的研究团体在其当前和未来的研究中实施 MALDI MSI,从基础生物学到转化研究。
人们必须始终牢记所有预防措施,以尽量减少样品制备过程中分子剖面(丰度和空间分布)的变化,避免污染。首先,尽量减少动物安乐死和组织采集之间的时间,如原地冷冻或微波固定加热,使大脑中的酶失活,以减少对死后缺血症的责任4,5,6。其次,样品的捕捉冻结状态至关重要。冷冻不足会导致代谢物的退化和损失,而过度冷冻会导致冷冻过程中的组织碎片。冷冻时间应始终根据先前报告的研究进行测试,本文中对发育小鼠大脑的研究为啮齿动物脑组织提供了参考点。第三,切割生物组织并将其部分转移到 ITO 幻灯片中需要充分实践。请务必注意,在使用画笔从舞台上拾取部分时,应小心使用画笔。允许刷毛只接触组织部分的边缘,以降低污染和部分碎裂的风险。尽可能平整滑梯上的部分,这样可以防止在手指加热期间卷曲该部分。第四,在安装到 ITO 幻灯片上时,请确保整个部分与 ITO 幻灯片连接良好,因为组织的不同区域可能需要不同时间的手指加热。例如,脑肿瘤组织需要比正常脑组织更长的加热时间。在 MALDI-MS 扫描过程中,安装不良可能导致组织分离和碎裂。请记住,手指变暖可能使酶作用和新陈代谢导致代谢的人工变化。第五,MALDI矩阵的精细和均匀沉积在实现准确的空间信息和强 MALDI-MS 信号方面发挥了重要作用。建议在空白幻灯片上测试矩阵喷洒,并在显微镜下观察晶体图案以验证适当的覆盖范围,然后再进行珍贵标本幻灯片的涂层。最后,由于单个研究人员以不同速度执行组织采集和滑动制备,因此最好由一个人在同一组中处理样本制备,以最大限度地减少变异。
协议提供了上述详细标准程序,可根据特定实验的需要进行定制。例如,通常用于样品冷冻分割的冷冻凝胶 OCT 可以进一步用作组织夹头的安装胶(如上文所述)。先前的研究表明,OCT中的聚合物成分会导致强烈的离子抑制14。然而,在没有聚合物凝胶的额外支持的情况下,嵌入样品可能是不可避免的。为了对抗这些情况下的信号抑制,组织可能需要用70%乙醇和95%乙醇的连续清洗清洗,以去除残留的OCT来检测蛋白质或脂质,而不建议清洗用于检测小分子代谢物9。
MALDI MSI 在研究实验室和临床实践环境中越来越相关。例如,MALDI MSI最近被证明在研究蛋白造物学,以描述一个有机体15的表型功能状态,并作为微生物识别和诊断随后疾病16的代理。虽然 MALDI MSI 支持广泛的应用,但仅依靠此技术存在一些限制,尤其是在区分相似物种或代谢物以及确定特定目标方面。另一个挑战是根据 MALDI MSI 信号对代谢物浓度进行量化。人们通常认为,MALDI MSI光谱中的离子丰度与解剖组织中相应分子物种的空间分布(或相对丰度)密切相关。然而,人们应该始终记住,离子强度与相应分子物种数量之间的关系是由许多因素造成的,包括但不限于离子抑制的影响、组织结构的变化和离子分子反应17。利用内部标准的技术可以实施在MALDI-MSI18中进行绝对量化(μmol/g组织)。这两个挑战通常通过 MALDI MSI 与液相色谱串联 MS (LC-MS/MS) 技术相结合的工作流程来解决,根据该技术,MALDI-MS 允许绘制感兴趣的区域图谱,该区域随后需要微切除和 LC-MS/MS 来提供更多信息来识别代谢物19。
近年来,基于MS的成像方法被开发出来,作为以前对小分子代谢物进行成像技术的替代方式。随着 MALDI MSI 的进步和日益普及,预计 MALDI 成像将成为可视化小分子的新标准工具。在生物环境中对脂质和内源性小分子(如神经递质和代谢物)进行成像,以及为开发新药剂而成像异生物,都特别令人感兴趣。预计在不久的20年,随着马尔迪MSI的应用,这三个领域将取得迅速进展。
The authors have nothing to disclose.
叶贺和里纳特·阿布扎利莫夫得到了纽约城市大学专业工作人员大会(PSC-CUNY)研究奖项目的支持。陈玉琪和凯利·维拉萨米得到了阿尔弗雷德·斯隆基金会CUNY暑期本科生研究计划的支持。
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
Autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) | Millipore Sigma Aldrich | 222488 | |
SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |