We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.
Hoewel de algemene architectuur van de hippocampus vergelijkbaar is langs zijn lengteas, hebben recente studies prominente verschillen in moleculaire, anatomische en functionele criteria aan het licht gebracht die wijzen op een verdeling in verschillende subcircuits langs de rostro-caudale omvang. Vanwege differentiële connectiviteit en functie wordt het meest fundamentele onderscheid gemaakt tussen de dorsale en de ventrale hippocampus, die bij voorkeur betrokken zijn bij respectievelijk ruimtelijke en emotionele verwerking. Dienovereenkomstig heeft in vivo werk met betrekking tot ruimtelijke geheugenvorming zich gericht op de dorsale hippocampus.
Elektrofysiologische in vitro opnames zijn daarentegen bij voorkeur uitgevoerd op intermediair-ventrale hippocampus, grotendeels gemotiveerd door factoren zoals de levensvatbaarheid van plakjes en circuitintegriteit. Om een directe correlatie van in vivo-gegevens over ruimtelijke verwerking met in vitro gegevens mogelijk te maken, hebben we eerdere doorsnedemethoden aangepast om zeer levensvatbare transversale hersensegmenten uit de dorsaal-intermediaire hippocampus te verkrijgen voor langetermijnopnamen van hoofdcellen en interneurons in de dentaat gyrus. Omdat ruimtelijk gedrag routinematig wordt geanalyseerd bij volwassen muizen, hebben we deze transversale snijprocedure gecombineerd met het gebruik van beschermende oplossingen om de levensvatbaarheid van hersenweefsel van volwassen dieren te verbeteren. We gebruiken deze aanpak voor muizen van ongeveer 3 maanden oud. De methode biedt een goed alternatief voor het coronale preparaat dat vaak wordt gebruikt voor in vitro studies op dorsale hippocampus. We vergelijken deze twee preparaten in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.
De hippocampus is uitgebreid bestudeerd voor zijn cruciale rol in verschillende aspecten van leren en geheugen, ruimtelijke navigatie en emotie. De basiscircuits van de hippocampus, gewoonlijk het “trisynaptische circuit” genoemd, is een lamellennetwerk in de dwarsas, dat grotendeels langs de lengteas1is bewaard gebleven. De bijdragen van de hippocampus aan verschillende cognitieve en emotionele gedragingen komen waarschijnlijk voort uit de diverse verbindingen die dit basiscircuit maakt langs de dorsoventrale as met verschillende andere hersengebieden2,3. Afgezien van afferente en efferente connectiviteit, wijzen een toenemend aantal studies echter op verdere verschillen langs de septo-temporele as van de hippocampus. Dergelijke verschillen hebben betrekking op de interne architectuur en connectiviteit , alsmede op verschillen in genexpressiepatronen en neuronale morfologie4,5,6,7,8.
Gezien het bestaan van dergelijke verschillen in de basiscircuits, is het redelijk om het specifieke hippocampale subcircuit te selecteren dat moet worden onderzocht op basis van de vragen die worden behandeld. Als de vraag bijvoorbeeld betrekking heeft op neuronale mechanismen die betrokken zijn bij ruimtelijke verwerking, is de dorsale in plaats van de ventrale hippocampus van belang, hoewel de twee niet onafhankelijk in vivo handelen als gevolg van intra-hippocampale longitudinale connectiviteit9,10,11. Langs deze lijnen moeten niet alleen de verschillen langs de lengteas worden overwogen, maar er moet ook zorgvuldigheid worden beoefend om lokale en langeafstandscircuits zo goed mogelijk te behouden. Voor het behoud van de vezelpaden en connectiviteit is de hoek waaronder de hersenen zullen worden doorsneden essentieel.
De eerste methode die in de literatuur werd gerapporteerd om het trysinaptische circuit op te nemen, isoleerde eerst de hippocampus uit de hersenen en maakte vervolgens dwarse plakjes (loodrecht op de lengteassen) met behulp van een weefselhakselaar12 en een vibratome13. Latere fysiologen gaven er de voorkeur aan om plakjes uit een heel hersenblok te verkrijgen om ook de aangrenzende hersenstructuren te behouden die verbonden zijn met de hippocampus. Voor deze blokpreparaten zijn verschillende doorsnedehoeken ten opzichte van de hippocampus ontwikkeld, zoals een coronale plakbereiding14 of een horizontaal plakpreparaat genaamd HEC-segment voor het behoud van hippocampal-entorhinale cortexverbindingen15,16,17.
In het laatste preparaat wordt de pariëtale kwab gesneden met een hoek van 0° of 12° ten opzichte van het horizontale vlak langs de rostro-caudale as om de basis van het blok te vormen. Plakjes worden vervolgens verzameld vanaf het ventrale oppervlak van de hersenen, waardoor voornamelijk de oogst van het tussen-ventrale hippocampale gebied mogelijk wordt. Deze methode is de meest populaire keuze geworden voor fysiologische studies en kan betrouwbaar worden uitgevoerd volgens verschillende gepubliceerde protocollen18,19,20.
Als het onderzoeksbelang echter betrekking heeft op specifieke aspecten van ruimtelijk leren, kan de dorsale hippocampus de meer geschikte onderzoeksregio zijn en zou het nuttig zijn om een snijprocedure van vergelijkbare kwaliteit te vinden voor deze hippocampale regio. Er zijn maar weinig protocollen ontwikkeld, die zich richten op de zeer rooskleurige pool, die aan deze vraag kunnen voldoen 21,22.
In dit protocol beschrijven we in plaats daarvan een benadering om levensvatbare dwarssegmenten te verkrijgen uit de dorsaal-intermediaire hippocampus die de eerder beschreven doorsnedehoek gebruikt voor horizontale preparaten18,19 ( figuur1A& B). We demonstreren de kwaliteit van dit protocol door elektrofysiologische opnames en morfologische reconstructies in dit preparaat te vergelijken met die verkregen in coronale plakjes. Dit protocol is met name geschikt voor combinatie met anatomische en gedragsexperimenten bij volwassen muizen (in ons geval drie maanden oud).
De dorsale hippocampus is uitgebreid bestudeerd voor zijn rol in ruimtelijk leren en navigatie, voornamelijk door gedragsexperimenten, anatomische tracering en regiospecifieke manipulaties. Om slice-electro-fysiologische onderzoeken met deze technieken te combineren, hebben we een protocol samengesteld dat een vergelijkbare doorsnedehoek gebruikt als het gewijzigde horizontale snijden voor het tussenliggende ventrale gebied van de hippocampus, maar een omgekeerde snijvolgorde gebruikt om vroege plakjes uit het dorsaal-tussenliggende gebied te verkrijgen. Deze aanpak vermindert de tijd die nodig is om het dorsale gebied van hippocampus te snijden en te verzamelen, waardoor de levensvatbaarheid van segmenten wordt verbeterd.
Met behulp van deze methode kunnen we routinematig ongeveer drie plakjes per halfrond van het dorsale hippocampale gebied tussen 1,4 mm-2,4 mm van het pialoppervlak ophalen, zoals weergegeven in figuur 1C. Hoewel het met deze procedure niet mogelijk is om transversale plakjes te verkrijgen van de zeer septale pool van de hippocampus, is het mogelijk om ongeveer twee extra levensvatbare niet-transversale plakjes per halfrond van de septale pool te verzamelen (figuur 1C ii,iii). Als de septale pool van de hippocampus de primaire onderzoeksfocus is, kunnen andere protocollen, die het verzamelen van transversale plakjes mogelijk maken, vooral van de zeer septale pool van de hippocampus, beter geschikt zijn21,32. Gedragsexperimenten op ruimtelijke navigatie en leren worden bij voorkeur uitgevoerd bij volwassen muizen met volledig ontwikkelde neuronale connectiviteit. Daarom hebben we onze snijprocedure geoptimaliseerd voor de toepassing op de hersenen van volwassen dieren (hier getoond voor muizen van drie maanden oud), die gevoeliger zijn voor stress dan het veerkrachtige juveniele preparaat. Hiertoe hebben we verschillende strategieën gecombineerd die de hypoxische stress verminderen waaraan de hersenen worden blootgesteld in de tijd tussen extractie en de plaatsing van de plakjes in het zuurstofrijke ACSF. De beschermende snijoplossing is een OP NMDG gebaseerde ACSF25,27,28 met lage Na+ en Ca2+ maar hoge Mg2+ om excitotoxische schade en celzwelling als gevolg van activering van NMDA-receptoren te verminderen. Daarnaast zorgt HEPES voor stabiele buffering en verminderen verbindingen zoals ascorbaat en pyruvaat oxidatieve stress. De transcardiale perfusie met de gekoelde en zuurstofrijke beschermende snijoplossing maakt gebruik van het extreem dichte capillaire netwerk dat de hersenen levert om de metabolische vraag en glutamaat-geïnduceerde excitotoxiciteit in het hersenweefsel snel en homogeen te verminderen. Vervolgens worden bijna alle stappen na onthoofding uitgevoerd binnen de gekoelde en zuurstofrijke oplossingen om het metabolisme en zuurstoftekort gedurende de hele procedure tot een minimum te beperken. Andere strategieën voor het verminderen van hersenbeschadiging tijdens het snijden bestaan en kunnen even geldig zijn38. Om de kwaliteit van onze bereiding aan te tonen, vergelijken we het met een coronale plakbereiding, die vaak wordt gebruikt om op te nemen vanaf de dorsale hippocampus. Hoewel coronale plakjes kunnen worden gebruikt om een goede patchklemopname in de dentate gyrus te verkrijgen, is het aantal ongezonde en losgekoppelde neuronen hoger dan in de transversale plak. Bovendien wordt de integriteit van de axonale en dendritische arborisaties beter bewaard in de transversale plak. In feite dient de integriteit van korrelcelaxonen (figuur 3A), die orthogonaal naar de lengteas van de hippocampus lopen, als indicator van een transversaal snijvlak1.
Voor het vullen van gepatchte neuronen stellen we een elektrodeweerstand tussen 3 en 5 MΩ voor. Een diameter van de punt van ongeveer 1 μm, maakt het mogelijk om een goede afdichtingsweerstand te bereiken tijdens het opnemen en een goede herafdichting bij het terugtrekken van de elektrode. Het meest cruciale detail is om het afzuigen van delen van de soma of kern in de pipet te voorkomen. Om deze reden raden we aan om indien mogelijk een Alexa-kleurstof in de intracellulaire oplossing op te nemen. De kleurstof maakt het mogelijk om de celvorm te controleren tijdens het opnemen en opnieuw afdichten. Bovendien maakt het mogelijk om de integriteit van de gepatchte cel na fixatie te beoordelen, wat immunohistochemietijd kan besparen, in gevallen van mislukte vullingen. Vanwege Alexa-kleurstoffen worden geblust met lange fixatietijd, raden we indien mogelijk korte fixatie aan.
Voor volgende immunostaining gebruiken we een protocol waarvoor het segment niet opnieuw hoeft te worden doorgesneden. We raden aan om de kleuring binnen een week na fixatie te maken. Hoe langer de plakjes in de koelkast blijven, hoe groter de kans op weefseldegradatie. Als een lange opslag niet kan worden vermeden, raden we aan de NaN3-concentratie in de PBS te verhogen tot 0,05% en deze wekelijks te vernieuwen. Immunostainring van de hele plak betekent dat de incubatietijden met primaire en secundaire antilichamen toenemen. Meestal is voor het onthullen van biocytine één nachtelijke incubatie bij 4 °C voldoende, maar in combinatie met de kleuring voor andere eiwitten kan de hele kleuringsprocedure veel langer duren. Permeabilisatie-blokkerende en anti-body incubatie moeten individueel worden geoptimaliseerd. Meestal zijn twee dagen voor het primaire antilichaam voldoende, terwijl één dag voldoende kan zijn voor de secundaire. We raden aan om de duur van de wasstappen te verlengen samen met langere antilichaamincubaties om de toename van de achtergrond te voorkomen.
In dit protocol hebben we een snijmethode gepresenteerd om transversale of bijna transversale hippocampale plakjes te verkrijgen die de neuronale levensvatbaarheid van volwassen weefsel behouden en een praktische aanpak om de morfologie en de neurochemische identiteit van de gepatchte neuronen te herstellen. Deze methode kan eenvoudig worden uitgevoerd om elektrofysiologische resultaten te matchen met anatomische en gedragsstudies gericht op het tussenliggende dorsale deel van de hippocampus.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Kerstin Kronenbitter en Didier Gremelle voor de technische hulp. We danken Umberto Morelli voor hulp bij grafische software en Mathias Hoppe voor videografie en videobewerking. Het werk in ons lab werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143, SFB 1461 (Project-ID 434434223) en GRK2154, de Medical Research Council grant G1100546/2 en Kiel University.
1mL syringes Omnifix-F | Braun melsungen AG | 9161406V | |
24 multiwells | SARSTEDT | 8,33,922 | |
81x criogenic vial storage box | Fisherscientific | 15-350-107B | storage chamber |
Alexa Hydrazide dye | Invitrogen | A10436 | |
Big scissor | Fine science tool | 14010-15 | graefe forceps |
Biocytin | IRIS biotech. | LS3510.0250 | |
Borosilicate Glass capillaries | Science products | GB150TF-10 | storage chamber |
Brush 5 | Leonhardy | 241 | Micro double spatula, L 150 mm, blade width 4 mm |
Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.2 | aCSF solution |
Carbon steel microtome blade | feather | C35 | |
Chloridric acid | Roth | K025.1 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | with Airyscan |
Cyanoacrylate glue | UHU | 509141 | |
Cyanoacrylate glue, n-butyl-ester VetBond | 3M | ||
EGTA | Roth | 3054.1 | |
Fiji ImageJ | fiji.sc | ||
Filter paper 113A | ROTILABO Roth | AP180.1 | |
Fine tip tweezer | Dumont | 0245fo | |
Glass becker (150 ml) | ROTILABO Roth | X690.1 | incubation chamber and dissection |
Glass Petri dishes (10 cm dia.) | ROTILABO Roth | 0690.1 | |
Glucose | Roth | X997.2 | aCSF solution |
Heated water bath | Grant Instruments Ltd | SUB14 | |
HEPES | Roth | 9105.4 | aCSF solution |
Isofluoran | baxter | 5239.2 | Anesthetic |
Large spatula | Roth | E286.1 | |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | |
Microfil | World precision instruments | MF34G | |
Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | |
N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF solution |
Normal goat serum | Sigma Aldrich | 566380 | |
Nylon mesh kit | Warner Instruments | 64-0198 | incubation chamber and storage chamber |
Paraformaldeyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
Phosphate buffered saline 10X | Panbiotech | P04-53500 | |
Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | |
Pipette puller | Sutter instrument | P-2000 | |
Pipette tips | SARSTEDT | 7,07,62,211 | incubation chamber |
Plastic box for syringe filters | SUPELCO | 54135-U | storage chamber |
Potassium Chloride | Roth | 6781.3 | aCSF solution |
Potassium Gluconate | Roth | P1847 | |
Probenbecker becker (100 ml) | ROTILABO Roth | HT85.1 | incubation chamber |
Rounded tip tweezers | Fine science tool | 11051-10 | |
Sainless steel blade | Gillette | Vibratome | |
Small scissor | Fine science tool | 14010-10 | mayo scissor straight |
Sodium Ascorbate | Roth | 3149.2 | aCSF solution |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
Sodium Bicarbonate | Roth | 6885.1 | aCSF solution |
Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | aCSF solution |
Sodium Hydroxide | Roth | K021.1 | |
Sodium Phosphate monobasicdihydrat | Roth | K300.1 | aCSF solution |
Sodium Pyruvate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
Streptavidin conjiugated Alexa 488 | Invitogen | s11223 | |
Thin spatula | Roth | E286.1 | Double spatula, L 150 mm, blade width 9 mm |
Transfer pipette | Sarstedt | 861171 | |
Triton x100 | Roth | 3051.1 | |
Vibratome | Thermoscientific | Microm HM650V | |
Filter device for ultrapure water | Merck-Millipore | Milli-Q IQ 7000 |