在体内评估小鼠的粘液清除

匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会在进行这些动物实验之前，批准了本出版物中指定的所有动物协议。 注：此协议详细说明了如何使用双模SPECT/CT扫描仪进行放射性核素成像的体内粘膜清除研究。所展示的技术包括运行系统校准、麻醉小鼠、小鼠气管插管、向肺部灌输同位素、双模成像、这些图像的共同注册以及分析。 1. 光谱/CT 系统设置 设计一个合适的工作流程，并在使用活体动物进行实验之前设置。 使用由 60 个投影组成的 SPECT 采集，在旋转半径为 40 厘米的投影之间步幅为 6o。CT 采集由 220 个投影组成，投影之间角度为 1.6o。 确保系统为小鼠提供正确的 MWB 校准器和 SPECT 成像。如果安装了不适当的校准器，请使用对准器向导安装正确的对准器。 运行必要的系统校准，为系统准备使用。注：扫描仪的SPECT和CT组件需要校准。使用源调理和暗/光 （D/L） 校准来校准 CT 组件，每 2 周进行一次中心偏移 （COS） 校准，并每月评估 X 射线硬件。SPECT 组件需要每年校准一次。 要评估 X 射线硬件，请检查 CT 校准期间 的评估 X 射线硬件 框（补充 CT 校准菜单）。 要执行源调理，请在 CT 校准期间检查 执行源调理 框（补充 CT 校准菜单）。 要执行 D/L 校准，请检查 CT 校准期间实验中使用的 CT 采集协议旁边的 D/L 框。取消检查所有其他协议（补充CT校准菜单）。 要执行 COS 校准，请用校准环工具替换床，调整床型设置以匹配运动控制设置，并在 CT 校准期间的实验中使用的 CT 采集协议旁边检查 COS 框。取消检查所有其他协议（补充CT校准菜单，补充校准环）。 2. 鼠标灌输和灌输 称重要扫描的鼠标。如果扫描多个鼠标，请注意使用耳击或尾部标记等方法为识别目的标记小鼠。 使用 1.5% 异氟化物麻醉鼠标，气体流量为 2 L/min O2，在气室中持续约 5 分钟，以产生足够深度的麻醉，直到呼吸速度减慢到每分钟16 次 55-65次呼吸（图 1A）。 将鼠标从腔室中取出，在 45o斜坡的灌管支架上由前切口悬挂。用鼻锥装备插管支架，以确保小鼠在插管过程中麻醉（图1B）。 将 50μm 光纤线的一端连接到光源，并用电线将 20 光纤管穿线（图 1C）。 打开鼠标的嘴，用钝钳把舌头向前拉。照亮导线，并用它来可视化声带（图1D）。 通过声带的导线，使电线刚刚超越声带，并在上气管休息。沿着钢丝向前滑动1英寸的管子，给老鼠做管子，通过足够深的管子，使其中心与动物的切口（图1E）相抗使。取出留下管子的电线。 通过用手指短暂地插入手杖并检查呼吸变化来测试插管。停止呼吸或呼吸紧张，同时堵塞和释放后加速呼吸是适当的气管插管的迹象。如果堵塞手杖后呼吸模式没有变化，后者很可能在食道中。 在10μL的体积中准备 9900万个技术硫胶体（99mTc-Sc）的0.2 mCi，并将移液器放入管子中。让老鼠在1-2分钟（图1F）内自发地吸入肺部。在将鼠标转移到扫描仪托盘之前取出手杖。注：放射性核素是由红衣主教健康公司制备和过滤的。 3. 光谱/CT 成像 将鼠标转移到带鼻锥的25毫米托盘中，用胶带固定，注意不要将胸部和腹部粘得太紧，以免损害呼吸。请小心删除连接到鼠标的任何金属耳标。 在 200 μL 中制备由 0.05 mCi 组成的放射性幻影，并将此量放置在 0.2 mL PCR 管中。通过将管子贴在小鼠下腹部下方的托盘上，避免与肺部重叠，从而放置管子。注：幻影用于共同注册CT和SPECT图像，以及清除的负控制。 将鼠标插入SPECT/CT系统，选择成像工作流程并运行 “设置”。 设置鼠标上探测器的定位，并运行成像工作流程。 为手术后接受放射性的老鼠准备一个笼子，不受限制地获得食物和水，并使用辐射安全贴纸进行清晰的标签。 工作流程完成后，将鼠标从成像托盘中取出，并允许鼠标在预制的笼子中恢复，扫描（扫描结束 1 至扫描 2 开始）之间持续 6 小时，并允许广告利比图姆获得食物和水。选择 6 小时，因为它对应于根据 cilia 功能进行线性间隙的时间段，而紫藤间隙很少。 6小时后，重新麻醉鼠标并扫描，连同幻影，使用相同的工作流程来测量从气道中清除的同位素量。注：让小鼠恢复至关重要，因为连续6小时用异氟兰麻醉会导致显著的胆汁抑制作用，导致近零粘膜间隙。 4. 分析 成像后，执行后处理以重建完整的 3D 堆栈图像。 使用 99mTc 的出厂标准设置对 SPECT 图像进行直方图，然后使用 MAP3D 算法和点点分布功能 （PSF） 重建进行重建。注：重建使用8次迭代和6个子集进行。有效的重建需要将子集与 1：10 的预测进行比对，或均匀地划分为预测数，因此使用 60 个投影进行收购使用了 6 个子集。 使用费尔德坎普算法和谢普-洛根过滤器重建CT图像。注：重建是使用4次迭代进行的。 使用残片工具处理 FIJI ImageJ21 中的 CT 和 SPECT 图像，从默认轴向图像生成日冕视图图像。然后在 SPECT 图像上执行 z 堆栈总和投影，以添加每个切片的计数数据，并生成单个图像以便于分析。 调整大小并共同注册CT和SPECT图像使用幻影埃彭多夫管作为参考（图2A，B）。跟踪并使用所有样品的一致调整尺寸测量。 使用自动阈值对 CT 图像进行二进制，然后倒置堆栈，并执行 z 堆栈总和投影，生成肺部轮廓以供分析（图 2C）。 旋转 CT 和 SPECT 图像，并使用通道工具合并图像。通过在右肺周围绘制投资回报率并测量（图 2D）来计算 MCC。注：此测量将计算右肺 0 和 6 小时时间点的总计数，使用公式更正 6 小时图像以进行放射性衰变：N（t）= N0e+t.99米Tc-Sc 的衰变常数为每秒 3.21e=5，半衰约 6 小时。然后，这些值可用于计算百分之百的间隙。注：右肺被选为投资回报率图纸和测量计数，因为粘膜间隙将把放射性同位素从肺部输送到咽部，从那里吞咽，最后在胃中。很多时候，计数可以看到在胃，可能与左肺重叠，从而产生错误的计数。这种混淆可以通过测量右肺的计数来避免。