JoVE Journal > Biology
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

Farelerde Mukozdiliyel Temizliğin In vivo Değerlendirilmesi

Published: December 18, 2020
doi:
10.3791/61929
,
1Department of Developmental Biology,University of Pittsburgh School of Medicine

概要

Bu yayında, çift modalite radyonüklid görüntüleme kullanarak in vivo farelerde hava yolu mukozirary boşluğunu (MCC) değerlendirme protokollerini açıklıyoruz. Bu protokol, çift SPECT/CT sisteminde fare tüm gövde (MWB) kolimatörleri kullanılarak tek bir foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ve bilgisayarlı tomografi (BT) alma protokolü için tasarlanmıştır.

Abstract

Hücrenin özel organelleri olan solunum motile cilia, solunum yollarını kaplayan epitel hücrelerinin apikal yüzeyini hizalar. Metakronal, senkron bir şekilde yenerek, bu çoklu, hareketli, aktüer bazlı organeller, solunan kirleticilerin ve patojenlerin solunum yollarını temizleyen bir sefalad sıvı akışı oluşturur. Artan çevre kirliliği, yeni viral patojenler ve ortaya çıkan çok ilaca dirençli bakteriler ile cilia, üretilen mukoziyel boşluk (MCC) akciğer sağlığını korumak için gereklidir. MCC ayrıca primer silier diskinezi, kistik fibrozis gibi birden fazla doğumsal bozuklukta ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi edinilmiş bozukluklarda depresyondadır. Tüm bu bozukluklar, bazı durumlarda birden fazla fare modeli oluşturmuştur. Bu yayında, in vivo farelerde MCC’yi doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek için az miktarda radyoaktivite ve çift modalite SPECT / CT görüntüleme kullanarak bir yöntemi detaylandırıyoruz. Yöntem, görüntülemeden sonra farelerin iyileşmesine, seri ölçümlerin mümkün hale getirilmesine ve potansiyel terapötiklerin zaman içinde uzunlamasına test etmesine izin verir. Vahşi tip farelerdeki veriler, detaylara yeterli dikkat gösterdiği ve protokole kesinlikle uyulduğı sürece MCC ölçümünün tekrarlanabilirliğini göstermektedir.

Introduction

Cilia, alglerden insanlara evrimsel tarih boyunca korunan mikrotübül bazlı hücresel organellerdir. Hücre yüzeylerinden çıkarlar ve yerel çevreselduyusal sinyallerin tanınmasından hareketliliğine, insanlardan erken tek hücreli ökaryotik organizmalara kadar izlenebilen işlevler2,3. Cilia, çevresel sinyalleri işlemek için bir hücrenin özel anteni olarak hareketli olmayan ve tek hizmet verebilir; veya alveollere giden terminal bronşioller hariç fallop tüplerinin astarı ve üst ve alt hava yolları gibi sıvı akışı oluşturmak için senkronize, metakronal dalgalarda dövülen hareketli veçoklu.

Solunum yollarının geniş epitel yüzeyi, çeşitli potansiyel olarak tehlikeli solunan kirleticiler ve patojenler şeklinde sürekli bir kirlenme yaylım ateşine maruz kalır ve bir savunma gerektirir. Önemli bir savunma mekanizması, trakeo-bronşiyal epitel hücrelerinin apikal yüzeylerini kaplayan birden fazla hareketli cilia’nın dövülmesiyle sürekli salgılanan mukusun akışının mekanik olarak hava yolundan taşındığı trakeobronşiyal ağacın mukozal aparatıdır. Solunan kirleticileri tuzağa çekmek için bu işlevler ve sürekli, senkron dayak yoluyla, onları sefalad4,5taşır.

Cilia’nın, embriyonik düğümdeki hareketli cilia’nın simetriyi kırdığı embriyoların geliştirilmesinde sol-sağ desenlemenin geliştirilmesi gibi kilit rollere sahip olduğu gösterilmiştir6. Cilia ile ilişkili genlerdeki mutasyonlar, kalbin asimetrik yapısına bağlı olarak konjenital kalp hastalığı (CHD) gibi hastalıklarla bağlantılıdır6. Son çalışmalar, CHD’li hastaların solunum yollarında silier disfonksiyon insidansının yüksek olduğunu, ayrıca üst ve alt hava yollarında ameliyat sonrası solunum komplikasyonları ve kronik solunum yolu semptomlarının yaygınlığının arttığını bildirmiştir 7,8,9,10. Heteroaksili veya heteroaksisiz CHD ve silier disfonksiyonlu hastaların ameliyat sonrası solunum komplikasyonu ve negatif solunum yolu sonuçları riskinin arttığı gösterilmiştir5,8,10. Sinyalizasyon ve gelişimdeki rollerinin ötesinde, hava yolu ciliasının önemi, birincil siliary diskinezi (PCD) olan ciliopatiler tarafından gösterilmiştir. PCD, hareketli solunum ciliasını etkileyen, tekrarlayan akciğer enfeksiyonlarına, bronşektazise ve potansiyel olarak akciğer nakli ihtiyacına yol açan bir dizi mutasyondan kaynaklanan bir doğumsal bozukluktur11. Ek olarak, Kafkas popülasyonunda en sık görülen konjenital bozukluk olan kistik fibroziste (CF) cilia normal olsa da, MCC CFTR geninde mutasyonlardan kaynaklanan kalın, viskoz mukus nedeniyle bozulur12. PCD ve CF’nin birden fazla fare modelinin yanı sıra giderek artan sayıda CHD modeli vardır. Sonuçta cilia birçok kilit rollere sahip çok yönlü yapılardır ve hareketli solunum cilia in vivo işlevini değerlendirmek için bir yöntem klinik öncesi çalışma için değerli olabilir ve mutasyonların yanı sıra ilaçların mukozik boşluk (MCC) üzerindeki etkilerini değerlendirmek için değerli olabilir13. Yöntem, bu fare modellerinde yeni ilaçların, gen tedavisinin veya müdahalelerin MCC üzerindeki etkilerini değerlendirmede de değerli olacaktır.

MCC’yi değerlendirmek için kullanılan birçok farklı model vardır. Önemli bir yöntem, bronşlara aşılanmış metilen mavi boyanın kullanımını içerir, boya hareketinin fiberoptik ölçümü ile ölçülen boşluk14. Bu yöntem, insanlarda klinik öncesi fare modellerine göre daha rutin olan boyanın hareketini gözlemleme yeteneği ile sınırlıdır. Bir diğer önemli yöntem, bir hava yolundaki tek tek parçacıkları izlemek için kullanılabilen senkrotron faz kontrastlı X-ışını görüntülemesidir (PCXI). Bu yöntem nispeten yenidir ve yaygın olarak erişilemez15. Video-mikroskopi için bir trakeayı ekströte ederek hava yolunu değerlendirmenin çok sayıda ex vivo yöntemi vardır, ancak bu modeller insan hastalarda çok az fayda sağlar16. Optik tutarlılık tomografisi gibi cilia görüntüleme için yüksek çözünürlüklü teknikler aynı şekilde sınırlıdır17.

Bu yazıda, sayısız hayvan modelinde akciğer boşluklarını ölçmek için kullanılan MCC in vivo’nun yanı sıra kronik obstrüktif akciğer hastalığında MCC’yi incelemek ve immünsüpresif ilaçların etkilerini değerlendirmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz18,19. Bu yöntem, akciğerlere aşılandıktan sonra çözünmeyen bir partikül radyotracer olan radyofarmasötik 99m technetium-kükürt kolloidinin(99mTc-Sc) açıkluğunu izler. Radyonüklid daha sonra tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT)18,20kullanılarak izlenebilir. Çift modalite SPECT ve bilgisayarlı tomografi (BT) görüntüleme kullanarak, radyoizotop sayımlarının akciğerlere birlikte lokalizasyonu ve bu sayımlardaki azalmayı 6 saat boyunca ölçerek MCC’yi ölçmek için bu tekniği daha da iyileştirdik. BT ve SPECT görüntülerinin birlikte kaydedilmesiyle çift modalite görüntüleme, radyasyon sayılarının ilgi alanımız olan akciğerlere doğru lokalizasyonunu sağlar. Farelerde MCC ölçümü için yöntemi ayrıntılı olarak açıklamamıza rağmen, protokol sıçanlarda MCC’yi incelemek için ayarlanabilir. Kollatörlerin radyasyon dozunu da ayarlamaları gerekir. Bizim görüşümüze göre, fare MCC taramaları küçük hayvan boyutu nedeniyle teknik olarak daha zordur, ancak bir dizi insan bozukluğunun çok sayıda yerleşik fare modeli nedeniyle sıçanlardan daha yararlıdır. Ek olarak, hayvan kolonilerinde daha düşük maliyet ve bakım maliyeti nedeniyle, farelerde daha büyük bir örnek boyutu daha mümkündür.

Protocol

Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, bu hayvan deneylerinden herhangi birini üstlenmeden önce bu yayında belirtilen tüm hayvan protokollerini onayladı. NOT: Bu protokol, çift modlu SPECT/CT tarayıcı ile radyonüklid görüntüleme kullanılarak in vivo mukozit temizleme çalışmalarının nasıl gerçekleştirildiğini detaylandırmamaktadır. Gösterilen teknikler sistem kalibrasyonları, uyuşturma fareleri, farelerin trakeal entübasyonu, izotopun akciğerlere aşılanması, çift modalite görüntüleme, bu görüntülerin birlikte kaydedilmesi ve analizdir. 1. SPECT/CT sistem kurulumu Uygun bir iş akışı tasarlayın ve canlı hayvanları kullanarak deneyler yapmadan önce ayarlayın. 40 cm dönüş yarıçapına sahip projeksiyonlar arasında adım boyutu 6o olan 60 projeksiyondan oluşan bir SPECT alımı kullanın. CT alımı, projeksiyonlar arasında 1,6o açıya sahip 220 projeksiyondan oluşur. Sistemin fareler ve SPECT görüntüleme için doğru MWB kolimatörlerine sahip olduğundan emin olun. Uygun olmayan kolimatörler yüklüyse, doğru olanları yüklemek için kolimatör sihirbazını kullanın. Sistemi kullanıma hazırlamak için gerekli sistem kalibrasyonlarını çalıştırın.NOT: Tarayıcının SPECT ve CT bileşenlerinin kalibrasyona ihtiyacı vardır. CT bileşenlerini günde bir kez kaynak koşullandırma ve Koyu/Açık (D/L) kalibrasyon, 2 haftada bir Merkez Ofset (COS) kalibrasyonu kullanarak kalibre edin ve x-ray donanımını her ay değerlendirin. SPECT bileşenlerinin yılda bir kez kalibre edilmesi gerekir. X-ray donanımını değerlendirmek için CT kalibrasyonları sırasında X-ışını donanımını değerlendir kutusunu işaretleyin(Ek CT Kalibrasyon Menüsü). Kaynak koşullandırmasını gerçekleştirmek için CT kalibrasyonları sırasında kaynak koşullandırmayı gerçekleştir kutusunu işaretleyin(Ek CT Kalibrasyon Menüsü). D/L kalibrasyonu gerçekleştirmek için, CT kalibrasyonları sırasında denemeler sırasında kullanılan CT alım protokolünün yanındaki D/M kutusunu işaretleyin. Diğer tüm protokollerin işaretini kaldırın (Ek CT Kalibrasyon Menüsü). COS kalibrasyonu gerçekleştirmek için yatağı kalibrasyon halkası aracıyla değiştirin, yatak tipi ayarlarını hareket kontrol ayarlarında eşleşecek şekilde ayarlayın ve CT kalibrasyonları sırasında denemeler sırasında kullanılan CT alım protokolünün yanındaki COS kutusunu işaretleyin. Diğer tüm protokollerin işaretini kaldırın(Ek CT Kalibrasyon Menüsü, Ek Kalibrasyon Halkası). 2. Fare Entübasyonu ve Aşılama Taranacak fareleri tartın. Birden fazla fareyi tarıyorsanız, kulak delme veya kuyruğun işaretlenmesi gibi yöntemleri kullanarak fareleri tanımlama amacıyla işaretlemeye özen edin. Nefes almak dakikada ~55-65 nefese kadar yavaşlayınçaya kadar yeterli derinlikte anestezi üretmek için bir gaz odasında~5 dakika boyunca 2 L / dk O 2 gaz akışı ile% 1.5 izofluran kullanarak bir fareyi uyuşturun 16 (Şekil 1A). Fareyi odadan çıkarın ve 45 o eğimdeki entübasyon standında ön kesici dişlerdenaskıya alın. Entübasyon sırasında farenin uyuşturulmasını sağlamak için entübasyon standını bir burun konisi ile donatın (Şekil 1B). 50 μm fiber optik telin bir ucunu bir ışık kaynağına bağlayın ve kılavuz görevi görmek için teli kullanarak üzerine 20 kalibrelik bir ampul geçirin (Şekil 1C). Farenin ağzını açın ve künt forseps kullanarak dili öne doğru çekin. Kılavuz teli aydınlatın ve ses tellerini görselleştirmek için kullanın (Şekil 1D). Kılavuz teli ses tellerinden geçirin, böylece tel ses tellerinin hemen ötesinde ve üst nefes borusunda dinlenir. Fareyi entübe etmek için 1 inçlik kanı tel boyunca ileri doğru kaydırın, kanı yeterince derine geçirin, böylece göbeği hayvanın kesici dişlerine karşıdır (Şekil 1E). Canülleri yerinde bırakarak teli çıkarın. Kanülü bir parmakla kısa bir süre takarak ve nefes almadaki değişiklikleri kontrol ederek entübasyonu test edin. Tıkanırken solunumun durması veya nefes almanın zorlanması ve serbest bırakıldığında hızlandırılmış solunum, uygun trakeal entübasyon belirtileridir. Canül takıldıktan sonra solunum modellerinde bir değişiklik yoksa, ikincisi yemek borusunda muhtemeldir. 10 μL hacimde 0,2 mCi 99mtechnetium-kükürt kolloid (99m Tc-Sc) hazırlayın ve pipeti canüle alın. Farenin 1-2 dakika boyunca akciğerlere kendiliğinden solumasına izin verin(Şekil 1F). Fareyi tarayıcının paletine aktarmadan önce tarayısı çıkarın.NOT: Radyonüklid Kardinal Sağlık tarafından hazırlandı ve filtrelendi. 3. SPECT/CT Görüntüleme Fareyi burun konisi ile 25 mm’lik bir palete aktarın ve bantla sabitleyin, solunumu bozmamak için göğsü ve karnı çok sıkı bantlamamaya dikkat edin. Fareye bağlı metal kulak etiketlerini çıkarmaya özen göster. 200 μL’de 0,05 mCi’den oluşan bir radyoaktif fantom hazırlayın ve bu miktarı 0,2 mL PCR tüpüne yerleştirin. Tüpü, farenin alt karnının altındaki palete bantlayarak, akciğerlerle çakışmayı önleyerek yerleştirin.NOT: Hayalet, CT ve SPECT görüntülerinin birlikte kaydedilmesinin yanı sıra boşluk için negatif bir kontrol amacıyla kullanılır. Fareyi SPECT/CT sistemine yerleştirin, görüntüleme iş akışını seçin ve Kur ‘u çalıştırın. Dedektörlerin fare üzerindeki konumunu ayarlayın ve görüntüleme iş akışını çalıştırın. İşlem sonrası radyoaktivite alan fareler için yiyecek ve suya sınırsız erişime sahip bir kafes hazırlayın ve radyasyon güvenliği etiketi kullanarak etiketlemeyi temizleyin. İş akışı tamamlandıktan sonra, fareyi görüntüleme paletinden çıkarın ve hazırlanan kafeste taramalar arasında 6 saat boyunca (tarama 1 ila tarama 2’nin başlangıcı) yiyecek ve suya reklam libitum erişimi ile iyileşmesine izin verin. 6 saat, cilia fonksiyonuna bağlı olarak doğrusal boşluğun çok az alveolar boşlukla gerçekleştiği zaman dilimine karşılık geldiği için seçildi. 6 saat sonra, fareyi yeniden uyuşturun ve hayaletle birlikte, hava yollarından temizlenen izotop miktarını ölçmek için aynı iş akışını kullanarak tarayın.NOT: Farenin 6 saat boyunca izofluran ile kesintisiz anestezi olarak iyileşmesine izin vermek, neredeyse sıfır mukozal boşlukla sonuçlanan önemli bir cilia-depresan etkisine yol açacaktır. 4. Analiz Görüntülemeden sonra, tam 3D yığın görüntülerini yeniden oluşturmak için işlem sonrası gerçekleştirin. Spect görüntülerini 99mTc için fabrika standart ayarlarını kullanarak histogramlayın ve ardından bir MAP3D algoritması ve nokta yayma işlevi (PSF) rekonstrüksiyonu kullanarak yeniden oluşturun.NOT: Yeniden yapılandırma 8 yineleme ve 6 alt küme kullanılarak gerçekleştirildi. Etkili bir yeniden yapılandırma, alt kümelerin 1:10’daki projeksiyonlara oranına veya projeksiyon sayısına eşit olarak bölünmesine ihtiyaç duyar, bu nedenle 60 projeksiyon kullanılarak elde edilmesi nedeniyle 6 alt küme kullanılmıştır. CT görüntülerini Feldkamp algoritması ve Shepp-Logan filtresi kullanarak yeniden yapılandırın.NOT: Yeniden yapılandırma 4 yineleme kullanılarak gerçekleştirildi. Varsayılan eksenel görüntülerden koronal görünüm görüntüleri oluşturmak için reslice aracını kullanarak FIJI ImageJ21’deki CT ve SPECT görüntülerini işleyin. Ardından, her dilimden sayım verilerini eklemek ve analiz kolaylığı için tek bir görüntü oluşturmak için SPECT görüntüsünde bir z yığını toplam projeksiyonu gerçekleştirin. Referans olarak hayalet Eppendorf tüpünü kullanarak CT ve SPECT görüntülerini yeniden boyutlandırın ve birlikte kaydedin (Şekil 2A,B). Tüm numunelerde tutarlı yeniden boyutlandırma ölçümlerini izleyin ve kullanın. Ct görüntüsünü otomatik eşik kullanarak binarize edin, ardından yığını ters çevirin ve analiz için akciğerlerin anahattını oluşturmak için z yığını toplam projeksiyonu gerçekleştirin (Şekil 2C). CT ve SPECT görüntülerini döndürün ve kanal araçlarını kullanarak görüntüyü birleştirin. Sağ akciğerin etrafına bir yatırım getirisi çizerek ve ölçerek MCC’yi hesaplayın (Şekil 2D).NOT: Bu ölçüm, 0 ve 6 saatlik zaman noktaları için sağ akciğerdeki toplam sayımlardan olacak ve 6 saatlik görüntüler radyoaktif bozunma için aşağıdaki formül kullanılarak düzeltilecektir: N(t) = N0e−t. 99m Tc-Sc, ~6 saatlik yarı ömrü ile saniyede 3,21e−5 çürüme sabitine sahiptir. Bu değerler daha sonra bir yüzde boşluğu hesaplamak için kullanılabilir.NOT: Mukoza boşluğu radyoizotopu akciğerlerden farenkse yutulacağı yerden taşıyacak ve mideye düşeceğinden, yatırım getirisi çizimi ve ölçüm sayıları için sağ akciğer seçilir. Midede oldukça sık sol akciğerle örtüşebilecek ve bu nedenle hatalı sayımlar üretebilecek sayımlar görülebilir. Bu kafa karıştırıcı sadece sağ akciğerdeki sayımlar ölçülerek önlenebilir.

Representative Results

Bu protokolü kullanarak, fareleri bir izofluran odasında uyuşturduk (Şekil 1A). Yeterli anestezi seviyesine ulaştıktan sonra, fareler dikey desteklere yerleştirildi (Şekil 1B) ve ses telleri aydınlatılmış bir kılavuz tel kullanılarak görselleştirildi (Şekil 1C-1D). Fareler entübe edildi ve bir kanül aracılığıyla 10 μL hacimlerde 0.2 mCi 99mTc-Sc ile aşılandı ve akciğerlere kendiliğinden solunmasına izin verildi (Şekil 1E-1F). Görüntü alımı ve işlenmesinden sonra, CT ve SPECT görüntüleri, hayalet tüpü bir dönüm noktası olarak kullanarak (Şekil 2A) kolokalize edildi (Şekil 2B). Akciğerlerin maskeleri BT görüntüsünden (Şekil 2C) oluşturuldu ve 0 ( Şekil 2D ) ve 6 saatte(Şekil2E-2F)analiz için sağ akciğerin etrafına ROI çekmek için kullanıldı. Protokolün tekrarlanabilirliğini test etmek için, aynı deneysel koşullarla farklı günlerde toplam 8 fare iki kez tarandı ve tekrar taramaları arasında önemli bir fark olmadığını gösteren eşleştirilmiş bir t testi kullanılarak analiz edildi (p-value=0.9904) (Şekil 3A). Aynı deneysel koşullarla farklı günlerde üç kez ek 2 fare tarandı, tek yönlü ANOVA kullanılarak yapılan analizler tekrar taramaları arasında önemli eşleşmeler gösterdi (p değeri 0.0041) (Şekil 3B). Toplam 8 fare tarandı ve iki temsili görüntü görüntülendi (Şekil 4). Şekil 1: Fare entübasyonu ve izotop aşılaması. İzotopun entübe olması ve hava yoluna aşılası için gereken adımların görüntüleri. A) Fare bir odada uyuşturulur. B)Uyuşturulmuş fare, ön kesici dişler tarafından askıya alınmış dikey bir desteğe yerleştirilir. C) Kılavuz tel olarak hizmet veren ışıklı 0,5 mm fiber optik tel, 20 G’lık bir canülden çalıştırılarak hazırlanır. D) Farenin ağzı forseps kullanılarak açılır ve ses tellerini görselleştirmek için ışıklı kılavuz tel kullanılarak aydınlatılır. E) Canül ses telleri boyunca itilir ve kılavuz tel çıkarılır. F) Çözünür izotop bir pipet kullanılarak kanüle aşılanır ve farenin izotopu akciğerlere kendiliğinden solumasına izin verilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: MCC taramasının SPECT/CT görüntüleri. A) CT görüntüsüyle birlikte yerelleştirilmiş bir SPECT görüntüsü. B)Birlikte lokalizasyon için kullanılan görünür bir fantom tüplü CT görüntüsü. C) CT görüntüsünün binarizing ve bir z-yığın toplam projeksiyon gerçekleştirme tarafından türetilen hava yolu maskesi. D) CT maskesi SPECT görüntüsüyle birlikte yerelleştirildi. Sağ akciğerin etrafına analiz için bir yatırım getirisi çizilmiş. E) 6 saatte hava yolunun maskesi. F) Analiz için bir yatırım getirisi ile 6 saatte hava yolunun CT ve SPECT birlikte lokalize görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Aynı farelerin birden fazla taramada boşluk ölçümleri. A) Deneysel koşullarda değişiklik olmayan 8 fare için iki ayrı tekrar boşluk ölçtü. Eşleştirilmiş bir t testi, p değeri 0.9904 olan tekrar taramaları arasında önemli bir fark olmadığını gösterdi. B) Deneysel koşullarda değişiklik olmayan iki fare için üç ayrı tekrar boşluk ölçtü. Tek yönlü bir ANOVA, p değeri 0.0041 olan tekrar taramaları arasında önemli bir eşleşme olduğunu gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Sağ akciğeri özetleyen 0 ve 6 saatte çizilmiş ROI’ler ile 2 farede 0 ve 6 saatlik hava yolunun birlikte lokalize SPECT /CT görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 1: Nefes almanın etkisiyle fiber optik tel ile aydınlatılan ses tellerinin videosu görselleştirildi. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Dosyalar. Bu dosyaları indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Hareketli solunum cilia’nın hem hastalık hem de gelişimdeki rolü gelişmeye ve daha iyi takdir olmaya devam ediyor. Trakeobronşiyal ağacı astarlayan hücrelerin apikal yüzeyinde birden fazla motile cilia’nın senkron, metakronal dövülmesi, mukozal boşluk veya MCC üreten sefalad akışı oluşturur. MCC, PCD22, KOAH18gibi edinilmiş hastalıklar gibi ciliopatilerde tehlikeye girer ve önemi geleneksel olarak ciliopati olarak kabul edilmeden CHD’lerde tanınmaktadır. Son veriler hem HETEROTAKSİ23 hem de heterotaksi7olmadan hem CHD’de solunum siliary disfonksiyonu göstermiştir. Bu tür hareketli cilia disfonksiyonu daha büyük solunum semptomları9 ve daha fazla ameliyat sonrası morbidite8‘e çevrildiği gösterilmiştir. Hepsi olmasa da, bu hastalıkların çoğunda fare modelleri mevcuttur ve farelerde MCC’yi ölçme protokolümüz potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek değerli bir araçtır.

Hayvan modelleri hastalıkları anlamak ve tedavilerin geliştirilmesi için fayda sağlar. In vivo hayvan görüntüleme, hayvanları feda etmeye gerek kalmadan aynı hayvanlardan birden fazla veri noktası elde etme yeteneği ile daha fazla yardımcı program sağlar ve araştırmacıların hastalığın boyuna seyrini ve tedavi etkilerinin çalışma süresini izlemelerine izin verir. MCC’nin fare modeli on yıllar boyunca birden fazla araştırmacı tarafından geliştirilmiştir, başlangıçta iki boyutlu bir nükleer görüntüleme tekniği olan düzlemsel sintigrafi kullanılarak beagle köpekleri üzerinde gerçekleştirilir24. Teknik on yıl sonra farelerde kullanılmak üzere uyarlandı, ardından spect görüntülemeye adaptasyon on yıl sonra25,26. Fare modellerinde bu tekniğin geliştirilmesi, silier fonksiyonun önemli ölçüde değiştiği PCD gibi insan hastalıklarının birden fazla fare modelinin bulunması nedeniyle bu tekniğin ilgisinde önemli bir gelişmeydi. MCC, akciğer denervasyonu ve immünosupresyon fare modellerinde değerlendirilmiştir ve diğer modellerle birlikte kullanılma potansiyeline sahiptir19,26. CHD ile ilişkili CF, astım, PCD ve ciliopatiler gibi hava yolu hastalıkları olan insan hastalarında MCC ölçüm çalışmaları yapılmıştır ve tekniğin hem akciğer fizyolojisi çalışmalarına hem de terapötik etkinlik çalışmalarına yardımcı olabileceğine dair sonuçlar13.

Bu protokolün önemli bir parçası, nicelik için doğru görüntüler elde etmek için doğru görüntüleme parametreleriyle alımlar ayarlamaktır. Hangi kolimatörlerin kullanıldığı, devir başına elde edilen projeksiyon sayısı ve döndürme adımı boyutu da dahil olmak üzere SPECT alım ayarlarını tasarlarken bir dizi faktör anahtardır. Kolimatör seçimi, alımın hassasiyetinde ve çözümünde önemli bir faktördür ve alım ayarlarının kullanılan kolimatöre uyarlanmış olması gerekebilir27. Alternatif olarak, sıçanlar gibi daha büyük hayvanlar kullanırken, kolimatörlerin ayarlanması gerekir. Örneğin birden fazla iğne deliği kolimatörleri daha hassastır, ancak üst üste binen projeksiyonları önlemek ve istenmeyen çoklamalara neden olmak için bir adım boyutu seçerken dikkatli olunmalıdır, bu da yeniden yapılandırma yapıtlarına neden olabilecek bazı görüntü belirsizliği pahasına kazanımın hassasiyetini daha da artırabilir25. Yeniden yapılandırma kurulumu, ölçülebilir görüntüler oluşturmak için de anahtardır. MAP3D yaygın olarak kullanılan bir yinelemeli rekonstrüksiyon algoritmasıdır ve PSF yaygın bir yeniden yapılandırma modelidir. Her ikisi de görüntüleri yeniden oluşturmak için güvenilirdir, ancak yinelemelerin ve alt kümelerin sayısını ayarlarken dikkatli olunmalıdır. Daha fazla sayıda yineleme, yeniden yapılandırma için gereken hesaplama süresini artıracak ve daha fazla arttıktan sonra azalan getirilerle yeniden yapılandırmanın kalitesini artıracaktır.

ImageJ’deki görüntüleri ölçmek için kullanılacak ideal ölçüm aracı, bir seçimdeki piksellerin toplam değerini çıkaran RawIntDen’dır. SPECT verilerini farklı boyutlardaki akciğer ROI’leri arasında ölçerken, RawIntDen kullanımı mutlak bir sayım ölçüsü sağlar ve ölçümün ortalama ölçümün21olacağı gibi yatırım getirisinin alanına ayarlanmasını önler.

Bu teknik, araştırmacının bu tekniği uygularken farkında olması gereken bir dizi ilişkili hata kaynağına sahiptir. Önemli bir kafa karıştırıcı anestezik ajanların kullanılmasıdır. Isoflurane, farelerin bir kazanımın tamamlanmasından sonra hızla kurtulduğu hızlı etkili, solunan bir anestezidir. Bununla birlikte, farelere kafeslerinde iyileşmeleri için bol zaman sağlamaya özen göstermeli ve gerektiğinden daha uzun süre uyuşturulmamalıdır. Kişisel deneyimimizde (yayınlanmamış veriler) 0 ila 6 saatlik zaman noktası arasında solunan izofluran kullanılarak sürekli uyuşturulmuş fareler ihmal edilebilir boşluk gösterdi. Aynı şekilde, hızlı iyileşmeyi sağlamak için kontrollü bir anestezi dozu da gereklidir. Hayvanı görüntüleme için palete sabitlerken, eserlerin akciğerlerle çakışmasını önlemek için ortak kayıt için kullanılan hayalet tüp midede düşük tutulmalıdır. Aynı şekilde, kaliteli bir CT görüntüsü sağlamak için, x-ışını saçılımından yapıtları önlemek için fareden herhangi bir metal etiketi çıkarmaya dikkat edin.

Mevcut MCC protokolü sayısız hayvan modeline uygulanabilir. Bu teknik taranan hayvanın sağlığı üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahiptir, fareler tarafından iyi tolere edilir ve bu nedenle zaten hassas farelerin sağlığını riske atmadan hastalık modelleriyle kullanılabilir. Bu metodolojinin gücü, ex vivo modellerinin26. Bu tekniğin aynı hayvanların birden fazla taramasında tekrarlanabilir ölçümler üretmedeki tutarlılığı, aynı hayvanın farklı ajanlar veya potansiyel terapötiklerle tedavi edilmesine ve herhangi bir hayvan modelinde bulunan biyolojik değişkenliği azaltmak için aynı hayvan arasında yapılan istatistiksel karşılaştırmalara izin verir, böylece istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermek için gereken örnek boyutunu azaltır.

MCC tekniği kullanılarak hava yolu fonksiyonunun değerlendirilmesi çeşitli hayvan modellerine ayarlanabilir ve yeni tedavilerin test edilmesiyle birlikte birçok farklı hava yolu sağlığı modeline uygulanabilir. PCD’nin fare modellerinin hava yolları, koah modellerinin yanı sıra bu teknik kullanılarak değerlendirilebilir. Yöntemimiz, çeşitli anesteziklerin MCC üzerindeki yaygın klinik kullanımda olan diferansiyel etkilerini incelemek için de kullanılabilir. Son olarak, terapötik ajanların hava yolu üzerindeki etkileri de bu model kullanılarak değerlendirilebilir. Daha önce belirtildiği gibi, ancak tekrar taşır, in vivo bir ölçüm olduğu için, bir hastalığın seyri boyunca MCC değerlendirmelerinin tekrarlanmasına ve zaman içinde terapötik müdahalelerin test yararlarına izin verir. Ek olarak, fareler, insan hastalıklarını taklit etmek / incelemek için kullanılan en yaygın laboratuvar hayvanlarıdır ve bazı durumlarda, insan hastalığının birden fazla transgenik fare modeli arasından seçim yapabilir.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.Z. ve K.S.F. ve bu çalışma, Pittsburgh Üniversitesi Klinik ve Çeviri Bilimi Enstitüsü aracılığıyla Pitt Innovation Challenge (PInCh) kapsamında verilen bir hibe ve M.Z’ye verilen NHLBI R01 hibesi HL153407 ile desteklendi.

Materials

500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire Edmund Optics 02-532
99mTechnecium-Sulfur Colloid Cardinal Health
Anesthesia Vaporizer Vetland Medical A13480
Durmont #5 Forceps Fine Science Tools 99150-20
FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software
Introcan Safety Catheters 20G 1inch Fisher Scientific NC1534477
Isoflurane Henry Schein 118-2097
Mouse Intubation Stand Kent Scientific ETI-MSE-01
Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT Siemens
Single Channel Anesthesia Stand Summit Anesthesia Solutions 22860
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Afzelius, B. A. Cilia-related diseases. Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).
  2. Mitchell, D. R. The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles. Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).
  3. Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella. Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).
  4. Randell, S. H., Boucher, R. C. University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).
  5. Wanner, A., Salathe, M., O’Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154, 1868-1902 (1996).
  6. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).
  7. Zahid, M., et al. Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries. PLoS One. 13 (2), 0191605 (2018).
  8. Stewart, E., et al. Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).
  9. Garrod, A. S., et al. Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease. Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).
  10. Harden, B., et al. Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome. Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).
  12. Donaldson, S. H., et al. Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR. JCI Insight. 3 (24), (2018).
  13. Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research. Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).
  14. Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil. Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).
  15. Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 551-558 (2012).
  16. Christopher, A. B., et al. The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia. Frontiers in Pediatrics. 2, 111 (2014).
  17. Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
  18. Lam, H. C., et al. Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).
  19. Bhashyam, A. R., et al. A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model. PLoS One. 7 (9), 45312 (2012).
  20. Ortiz, J. L., et al. Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists. PLoS One. 11 (10), 0164399 (2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Solomon, G. M., et al. Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography. JCI Insight. 2 (5), 91702 (2017).
  23. Nakhleh, N., et al. High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy. Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).
  24. Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs. Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).
  25. Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).
  26. Bhashyam, A. R., et al. Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation. Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).
  27. Van Audenhaege, K., et al. Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging. Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).

タグ

Mucociliary ClearanceIn Vivo EvaluationMiceRadionuclidesSPECT/CT ImagingAnesthesiaIntubationTechnetium Sulfur Colloid3D ReconstructionImage Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Feldman, K. S., Zahid, M. In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (166), e61929, doi:10.3791/61929 (2020).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image