JoVE Journal > Biology
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

In vivo Оценка слизистой очистки у мышей

Published: December 18, 2020
doi:
10.3791/61929
,
1Department of Developmental Biology,University of Pittsburgh School of Medicine

概要

В этой публикации мы описываем протоколы для оценки слизистой оболочки дыхательных путей (MCC) у мышей in vivo с использованием радионуклидной визуализации с двойным модальности. Этот протокол предназначен для единой фотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT) и протокола приобретения компьютерной томографии (КТ) с использованием коллиматоров мыши всего тела (MWB) в двойной системе SPECT/CT.

Abstract

Дыхательные пестрые реснички, специализированные органеллы клетки, выстилаются апиальной поверхностью эпителиальных клеток, выстилающих дыхательные пути. Избиение в метахрональной, синхронной моды, эти многочисленные, пестрые, актин основе органеллы генерировать поток головной жидкости очистки дыхательных путей от вдыхаемых загрязняющих веществ и патогенных микроорганизмов. С увеличением загрязнения окружающей среды, новых вирусных патогенов и новых бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, реснички генерируется слизистой очистки (MCC) имеет важное значение для поддержания здоровья легких. MCC также депрессии в нескольких врожденных расстройств, таких как первичная цилиарная дискинезия, муковисцидоз, а также приобретенные расстройства, такие как хроническая обструктивная болезнь легких. Все эти расстройства создали, в некоторых случаях несколько, мыши модели. В этой публикации мы подробно метод, использующий небольшое количество радиоактивности и двойной модальности SPECT / КТ изображения точно и воспроизводимо измерить MCC у мышей in vivo. Метод позволяет восстановление мышей после визуализации, что делает возможными серийные измерения, и тестирование потенциальных терапевтических продольно с течением времени. Данные на мышах дикого типа демонстрируют воспроизводимость измерения MCC до тех пор, пока уделяется достаточное внимание деталям, а протокол строго соблюдается.

Introduction

Cilia – это клеточные органеллы на основе микротрубочек, сохраненные в эволюционной истории от водорослей до людей. Они исходят от поверхностей клеток и имеют рядфункций 1,начиная от распознавания местных экологических сенсорных сигналов до подвижности, функции, которые могут быть прослежены от человека до ранних одноклеточных эукариотическихорганизмов 2,3. Cilia может быть не подвижной и одной выступающей в качестве специализированной антенны ячейки для обработки экологических сигналов; или пестрые и множественные, избиение в синхронизированных, метахрональных волн для генерации потока жидкости, например, в слизистой оболочке фаллопиевых труб и верхних и нижних дыхательных путей, за исключением терминала бронхиолы, ведущие к альвеолы1,2.

Обширная эпителиальная поверхность дыхательных путей подвергается постоянному шквалу загрязнения в виде различных потенциально опасных вдыхаемых загрязнителей и патогенных микроорганизмов, что требует защиты. Одним из ключевых защитных механизмов является слизистый аппарат трахеобронхиального дерева, где непрерывный поток выделяется слизь механически транспортируется из дыхательных путей путем избиения нескольких подвижных ресничок, выстилающих апические поверхности трахео-бронхиальных эпителиальных клеток. Эти функции, чтобы заманить вдыхали загрязняющих веществ, и через их непрерывное, синхронное избиение, транспортировать их головки4,5.

Cilia было продемонстрировано, что ключевые роли, такие как в развитии лево-правого узора в развивающихся эмбрионов, где пестрые реснички в эмбриональном узел разорватьсимметрию 6. Мутации в генах, связанных с реснички были связаны с такими заболеваниями, как врожденные пороки сердца (ИНД) из-за асимметричной структурысердца 6. Недавние исследования сообщили о высокой частоте цилиарной дисфункции в дыхательных путях пациентов с ИКД, а также увеличение распространенности послеоперационных респираторных осложнений и хронических симптомов дыхательных путей в верхних и нижнихдыхательных путях 7,8,9,10. Пациенты с ИКД и цилиарной дисфункцией, с или без гетеротаксиса, было продемонстрировано, что повышенный риск респираторных осложнений и негативныхреспираторных исходов послеоперационно 5,8,10. Помимо их роли в сигнализации и развитии, важность воздушных путей реснички была продемонстрирована ciliopathies, из которых ярким примером является первичной цилиарной дискинезии (PCD). PCD является врожденным расстройством в результате ряда мутаций, влияющих на подвижной дыхательной реснички, что приводит к рецидивирующим инфекциям легких, бронхиэктаз, и, возможно, необходимость трансплантациилегких 11. Кроме того, даже если реснички являются нормальными в муковисцидоз (CF), наиболее распространенным врожденным расстройством в кавказской популяции, MCC нарушается из-за толстой, вязкой слизи в результате мутаций в гене CFTR12. Существует несколько моделей мышей PCD и CF, а также постоянно растущее число моделей CHD. В конечном счете реснички являются универсальными структурами со многими ключевыми ролями, и метод оценки функции подвижной дыхательной реснички in vivo может быть ценным для доклинических исследований, а также оценки влияния мутаций, а также препаратов на слизистую оболочку (MCC)13. Этот метод также будет иметь ценность в оценке воздействия новых препаратов, генной терапии или вмешательства на MCC в этих моделях мыши.

Есть много различных моделей, которые были использованы для оценки MCC. Один заметный метод включает в себя использование метиленовый синий краситель, который был привит в бронхов, с клиренсом измеряется волоконно-оптических измеренийдвижения красителя 14. Этот метод ограничен способностью наблюдать движение красителя, который является более рутинным у людей, чем в доклинических моделях мыши. Другим примечательным методом является синхротронно-контрастная рентгеновская томография (PCXI), которая может быть использована для отслеживания отдельных частиц в дыхательных путих. Этот метод является относительно новым и не широко доступны15. Существуют многочисленные методы ex vivo оценки дыхательных путей путем источирования трахеи для видео-микроскопии, однако эти модели обеспечивают мало полезности упациентов 16. Методы высокого разрешения для визуализации ресничок, такие как оптическая томография согласованности, ограничены таким жеобразом 17.

В этой статье мы представляем воспроизводимый метод для измерения MCC in vivo, который был использован для измерения зазоров легких в бесчисленных моделях животных, а также изучения MCC при хронической обструктивной болезни легких и оценки воздействия иммуносупрессивныхпрепаратов 18,19. Этот метод отслеживает клиренс радиофармацевтического 99мтехнетия-сернистого коллоида(99мTc-Sc), нерастворимого радиотракера твердых частиц, после закапывания в легкие. Радионуклид можно отслеживать с помощью одной фотонной эмиссии компьютерной томографии (SPECT)18,20. Мы также усовершенствовали этот метод для измерения MCC с помощью двойной модальности SPECT и компьютерной томографии (КТ) изображения с совместной локализации радиоизотопных рассчитывает на легкие и измерения снижения этих рассчитывает в течение 6 часов. Двойная модальность изображения, с совместной регистрацией КТ и SPECT изображения позволяет точной локализации излучения рассчитывает на наш регион интереса, легких. Хотя мы подробно описываем метод измерения MCC у мышей, протокол может быть скорректирован для изучения MCC у крыс. Коллиматоры должны быть скорректированы, а также дозы облучения. На наш взгляд, сканирование мыши MCC являются более технически сложными из-за размера мелких животных, но более полезным, чем крысы из-за большого количества установленных моделей мыши ряда человеческих расстройств. Кроме того, из-за их более низкой стоимости и стоимости обслуживания в колониях животных, больший размер выборки является более возможным у мышей.

Protocol

Комитет по институциональному уходу за животными и использованию животных Университета Питтсбурга одобрил все протоколы животных, указанные в этой публикации, до проведения любого из этих экспериментов на животных. ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе подробно говорится о том, как проводить исследования по очистке слизистой оболочки виво с использованием радионуклидной визуализации с помощью сканера SPECT/CT с двойным модальности. Продемонстрированные методы : калибровка системы, обезболивания мышей, инкубация трахеи мышей, закапывания изотопов в легкие, двойная модальность визуализации, коинстрация этих изображений и анализ. 1. Настройка системы SPECT/CT Разработать соответствующий рабочий процесс и настроить до начала экспериментов с использованием живых животных. Используйте приобретение SPECT, состоящее из 60 проекций с размером шага 6o между проекциями с радиусом вращения 40 см. Приобретение КТ состоит из 220 проекций с углом 1,6o между проекциями. Убедитесь, что система имеет правильные коллиматоры MWB для мышей и SPECT изображений на месте. Если установлены неуместные коллиматоры, используйте мастер коллиматора для установки правильных. Запустите необходимые калибровки системы для подготовки системы к использованию.ПРИМЕЧАНИЕ: Компоненты SPECT и КТ сканера нуждаются в калибровке. Калибруйте компоненты КТ с помощью кондиционирования источника и калибровки Dark/Light (D/L) один раз в день, калибровки Center Offset (COS) каждые 2 недели и оценки рентгеновского оборудования каждый месяц. Компоненты SPECT необходимо откалибровать один раз в год. Чтобы оценить рентгеновское оборудование, проверьте поле для рентгеновского оборудования во время калибровки КТ(Дополнительное меню калибровки КТ). Для выполнения кондиционирования источника, проверьте поле кондиционирования источника Perform во время калибровки КТ(Дополнительное меню калибровки КТ). Для выполнения калибровки D/L проверьте коробку D/L рядом с протоколом приобретения КТ, используемым во время экспериментов во время калибровки КТ. Отменить все другие протоколы(Дополнительное меню калибровки КТ). Для выполнения калибровки COS замените кровать инструментом калибровочного кольца, отрегулируйте настройки типа кровати, чтобы соответствовать настройкам управления движением, и проверьте коробку COS рядом с протоколом приобретения КТ, используемым во время экспериментов во время калибровки КТ. Отменить все другие протоколы (Дополнительноеменю калибровки КТ, Дополнительное калибровочное кольцо). 2. Мышь Инкубация и закапывания Взвесь мышей для сканирования. При сканировании нескольких мышей, заботиться, чтобы отметить мышей для целей идентификации с использованием таких методов, как ухо штамповки или маркировки хвоста. Обезболивать мышь с помощью 1,5% изофлурана с потоком газа 2 л/мин O2 в газовой камере в течение 5 минут, чтобы произвести анестезию достаточной глубины, пока дыхание не замедлится до 55-65 вдохов в минуту 16 (Рисунок 1A). Удалите мышь из камеры и приостанавливайте передними резцами на интубации стенд на наклоне 45 o. Оборудуйте intubation стенд с конусом носа для того чтобы обеспечить мышь анестезировано во время intubation(рисунок 1B). Подключите один конец волоконно-оптического провода на 50 мкм к источнику света и нить 20-калиберной канюле над ним, используя провод, чтобы выступать в качестве руководства(рисунок 1C). Откройте рот мыши и потяните язык вперед с помощью тупых типсов. Осветите направляющий провод и используйте его для визуализации голосовых связок(рисунок 1D). Перейдите направляющий провод через голосовые связки так, чтобы провод был только за голосовыми связками и отдыхал в верхней трахее. Сдвиньте 1 дюймовый канюлю вперед вдоль провода, чтобы интубировать мышь, проходя канюлю достаточно глубоко, так что концентратор его против резцев животного (Рисунок 1E). Удалите проволоку, оставив канюлю на месте. Проверьте intubation, кратко подключив канюлю пальцем и проверяя изменения в дыхании. Остановленное дыхание или напряженное дыхание при подключении и ускоренном дыхании после освобождения являются признаками надлежащей пахты intubation. Если нет никаких изменений в дыхательных моделей при подключении канюли, последний, скорее всего, в пищеводе. Приготовьте 0,2 мСи из 99мтехнетия-серного коллоида(99м Tc-Sc) объемом 10 мкл и пипетку в канюлю. Разрешить мыши спонтанно вдыхать его в легкие в течение 1-2 мин (Рисунок 1F). Удалите канюлю перед передачей мыши на поддон сканера.ПРИМЕЧАНИЕ: Радионуклид был подготовлен и отфильтрован кардиналом здравоохранения. 3. SPECT/КТ визуализация Перенесите мышь на 25-мм поддон с носовой конусом и закрейте лентой, заботясь о том, чтобы не заклеить грудь и живот слишком плотно, чтобы избежать нарушения дыхания. Позаботьтесь, чтобы удалить любые металлические теги уха прилагается к мыши. Подготовь радиоактивный фантом, состоящий из 0,05 мСи в 200 мкл, и поместите это количество в трубку ПЦР объемом 0,2 мл. Распоить трубку, приклеив к поддону нижнюю часть живота мыши, избегая перекрытия с легкими.ПРИМЕЧАНИЕ: Фантом используется для совместной регистрации изображений CT и SPECT, а также отрицательного контроля за клиренсом. Вставьте мышь в систему SPECT/CT, выберите рабочий процесс изображения и запустите Setup. Настройка позиционирования детекторов на мыши и запуск рабочего процесса изображения. Подготовьте клетку для мышей, которые получили радиоактивность после процедуры, с неограниченным доступом к пище и воде, и четкой маркировки с помощью наклейки радиационной безопасности. По завершении рабочего процесса удалите мышь из поддона для визуализации и дайте ей восстановиться в подготовленной клетке в течение 6 часов между сканированием (конец сканирования 1 до начала сканирования 2) с доступом к пище и воде. 6 ч был выбран, поскольку он соответствует периоду времени, в котором линейное клиренс в зависимости от функции ресничок происходит с очень небольшим альвеолярного зазора. Через 6 часов, повторно анестезировать мышь и сканирования, вместе с фантомом, используя тот же рабочий процесс для измерения количества изотопов очищается от дыхательных путей.ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы мышь, чтобы восстановить, как непрерывная анестезия с изофлюраном в течение 6 часов приведет к значительному эффекту реснички-депрессии, в результате чего около нуля слизистых зазоров. 4. Анализ После визуализации выполните постобработку, чтобы реконструировать полные изображения 3D-стека. Гистограмма изображений SPECT с использованием заводских стандартных настроек для 99mTc, а затем реконструировать с помощью алгоритма MAP3D и функции распространения тока (PSF) реконструкции.ПРИМЕЧАНИЕ: Реконструкция была выполнена с использованием 8 итераций и 6 подмножей. Эффективная реконструкция требует соотношения подмножеов к прогнозам в 1:10 или равномерно разделить на количество прогнозов, поэтому 6 подмножеов были использованы из-за приобретения с использованием 60 прогнозов. Реконструйте КТ-изображения с помощью алгоритма Feldkamp и фильтра Шеппа-Логана.ПРИМЕЧАНИЕ: Реконструкция была выполнена с использованием 4 итераций. Обработать изображения CT и SPECT в FIJI ImageJ21 с помощью инструмента reslice для генерации корональных изображений представления с изображений по умолчанию. Затем выполните проекцию суммы z-stack на изображении SPECT, чтобы добавить данные о подсчете с каждого среза и создать единое изображение для простоты анализа. Зарегистрировать и совместно зарегистрировать КТ и SPECT изображения с помощью фантомной трубки Eppendorf в качестве ссылки (Рисунок 2A,B). Отслеживайте и используйте последовательные измерения размеров во всех образцах. Binarize КТ изображение с помощью автоматического порога, а затем инвертирование стека, и выполнение z-стек сумма проекции для создания контура легких для анализа (Рисунок 2C). Поверните изображения CT и SPECT и объедините изображение с помощью инструментов канала. Рассчитайте MCC, нарисовав рентабельность инвестиций вокруг правого легкого и измерения(рисунок 2D).ПРИМЕЧАНИЕ: Это измерение будет из общего числа в правом легком для 0 и 6 часов времени точек, с 6-часовой изображения исправлены для радиоактивного распада с использованием формулы: N(t) N0et. 99м Tc-Sc имеет константу распада 3,21е-5 в секунду с полуиммиллионом 6 часов. Эти значения могут быть использованы для расчета процентного зазора.ПРИМЕЧАНИЕ: Правое легкое выбрано для рисования и измерения рентабельности инвестиций, так как слизистая оболочка транспортируется радиоизотопом из легких в глотку, откуда она будет проглочена и в конечном итоге в желудке. Довольно часто, количество можно увидеть в желудке, которые могут перекрываться с левым легким и, следовательно, производят ошибочные подсчеты. Этого путаницы можно избежать, измеряя количество только в правом легком.

Representative Results

Используя этот протокол, мы анестезировали мышей в изофлюранной камере(рисунок 1A). После достижения адекватного уровня анестезии мышей поместили на вертикальные опоры(рисунок 1B),а голосовые связки визуализировали с помощью подсвеченного направляющейпроволоки (рисунок 1C-1D). Мышей интубировать и привить 0,2 мCi 99mTc-Sc в объемах 10 йл через канюлю и мышей позволили спонтанно вдыхать в легкие(рисунок 1E-1F). После приобретения и обработки изображений изображения CT и SPECT были колокализованы(рисунок 2A),используя фантомную трубку в качестве ориентира(рисунок 2B). Маски легких были созданы из КТ изображения(рисунок 2C) и используется для рисовать ROIs вокруг правого легкого для анализа на 0 (Рисунок 2D) и 6 часов (Рисунок 2E-2F). Чтобы проверить воспроизводимость протокола, в общей сложности 8 мышей были отсканированы дважды в разные дни с идентичными экспериментальными условиями, с анализом с использованием парного t-теста, показывающего никакой существенной разницы между повторным сканированием (p-value-0.9904) (Рисунок 3A). Еще 2 мышей были отсканированы три раза в разные дни с идентичными экспериментальными условиями, с анализом с использованием в одну сторону ANOVA показывает значительное соответствие между повторным сканированием (p-значение 0.0041) (Рисунок 3B). Всего было отсканировано 8 мышей и отображено два репрезентативных изображения(рисунок 4). Рисунок 1: Мышь intubation и изотопов закапывания. Изображения шагов, необходимых для intubate и привить изотопов в дыхательных путей. A) Мышь анестезируется в камере. B) Обезболивающее мышь помещается на вертикальную опору, подвешенную передними резцами. C) Освещенный 0,5 мм волоконно-оптический провод, выступающей в качестве направляющей проволоки готовится, запуская его через 20 G канюли. D) Рот мыши открывается с помощью типсов и освещается с помощью освещенного направляющей для визуализации голосовых связок. E) канюла толкаемых через голосовые связки и guidewire удаляется. F) Растворимый изотоп прививается в канюлю с помощью пипетки и мыши разрешено спонтанно вдыхать изотоп в легкие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: SPECT / КТ изображения сканирования MCC. A)Изображение SPECT, которое было совместно локализовано с изображением КТ. B)КТ-изображение с видимой фантомной трубкой, которая использовалась для совместной локализации. C)Маска дыхательных путей, полученная путем бинаризации изображения КТ и выполнения проекции суммы z-stack. D) КТ маска совместно локализована с изображением SPECT. Рентабельность инвестиций для анализа была нарисована вокруг правого легкого. E)Маска дыхательных путей в 6 часов. F) КТ и SPECT совместно локализованное изображение дыхательных путей в 6 часов с рентабельностью инвестиций для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Измерения зазора одной и той же мыши в нескольких сканирований. A)Два отдельных повторного зазора были измерены для 8 мышей без каких-либо изменений в экспериментальных условиях. Парный тест t показал, что не было существенной разницы между повторными сканами с p-значением 0.9904. B) Три отдельных повторных зазора были измерены для двух мышей без каких-либо изменений в экспериментальных условиях. Одноразовая ANOVA показала, что существует значительное соответствие между повторными сканами с p-значением 0.0041. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Co-локализованные изображения SPECT/CT 0 и 6 часов дыхательных путей у 2 мышей с ROIs, нарисованными на 0 и 6 часов с изложением правого легкого. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Дополнительный рисунок 1: Видео голосовых связок, освещенных волоконно-оптической проволоки с эффектом дыхания визуализированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру. Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.

Discussion

Роль подвижной дыхательной реснички как в болезни, так и в развитии продолжает развиваться и лучше цениться. Синхронное, метахронное избиение нескольких пестрых ресничок на апической поверхности клеток, выстилающих трахеобронхиаловое дерево, генерирует поток головки, производящий слизистую оболочку или MCC. MCC скомпрометирован в ciliopathies как PCD22, приобретенныезаболевания, как ХОБЛ 18, и его значение в настоящее время признается в CHDs, традиционно не считается ciliopathies. Последние данные показали, респираторной цилиарной дисфункции в обоих CHD сгетеротаксисией 23 и без гетеротаксисии7. Такие подвижной дисфункции реснички было показано, перевести в большихреспираторных симптомов 9, а также больше послеоперационной заболеваемости8. Большинство, если не все, из этих заболеваний, имеют мыши модели доступны и наш протокол для измерения MCC у мышей является ценным инструментом, который может быть использован для тестирования потенциальных терапевтических средств.

Модели животных обеспечивают полезность для понимания заболеваний и развития терапии. In vivo животных изображений обеспечивает дальнейшую полезность с возможностью приобретения нескольких точек данных от тех же животных, без необходимости жертвовать животных, что позволяет следователям следовать продольное течение болезни, а также изучение продолжительности лечения эффектов. Модель мыши MCC была разработана в течение десятилетий несколькими следователями, первоначально выполняется на бигль собак с помощью планарной сцинтиграфии, двумерной ядерной техники изображения24. Техника была адаптирована для использования у мышей десять лет спустя, а затем адаптация к SPECT изображений десять летпосле этого 25,26. Развитие этого метода в моделях мышей стало важным событием в актуальности этого метода, в связи с наличием нескольких моделей мыши человеческих заболеваний, таких как PCD, в которых цилиарная функция значительно изменяется. MCC была оценена в мышиных моделях денервации легких и иммуносупрессии, и имеет потенциал для использования в сочетании сдругими моделями 19,26. MCC измерения исследований у пациентов с заболеваниями дыхательных путей, таких как CF, астма, PCD, и ciliopathies, связанные с CHD были проведены, и дали результаты, что техника может помочь как исследования физиологии легких и терапевтическойэффективности 13.

Важной частью этого протокола является создание приобретений с правильными параметрами изображения для получения точных изображений для количественной оценки. При проектировании параметров приобретения SPECT ключевыми являются ряд факторов, включая то, какие коллиматоры используются, количество прогнозов для приобретения за революцию и размер шага вращения. Выбор коллиматора является важным фактором чувствительности и разрешения приобретения, и настройки приобретения, возможно, потребуется с учетом коллиматор используется27. Кроме того, при использовании больших животных, как крысы, коллиматоры должны быть скорректированы. Несколько коллиматоров пинхол, например, более чувствительны, но следует позаботиться о выборе размера шага, чтобы избежать перекрывающихся проекций и вызывая нежелательный мультиплексирование, что может еще больше повысить чувствительность приобретения за счет некоторой двусмысленности изображения, которая может вызвать артефактыреконструкции 25. Настройка реконструкции также является ключом к генерации поддающихся количественной оценке изображений. MAP3D является широко используемым итеративным алгоритмом реконструкции, а PSF является общей моделью реконструкции. Оба являются надежными для восстановления изображений, но следует позаботиться при установлении количества итераций и подмножеов. Большее число итераций увеличит вычислительное время, необходимое для реконструкции, и повысит качество реконструкции с уменьшением отдачи от дальнейшего увеличения.

Для количественной оценки изображений в ImageJ идеальным инструментом измерения является RawIntDen, который выводит сумму стоимости пикселей в выборе. При количественной оценке данных SPECT в различных размерах ИИ легких, использование RawIntDen обеспечивает абсолютную меру количества и позволяет избежать корректировки измерения в области рентабельности инвестиций, как среднее измерениебудет 21.

Этот метод имеет ряд связанных источников ошибки, что следователь должен быть осведомлен о при применении этого метода. Заметным путаница является использование анестезии. Isoflurane является быстро действует, вдыхали анестезию, что мыши оправиться от быстро после завершения приобретения. Тем не менее, следует позаботиться, чтобы обеспечить мышей достаточно времени, чтобы восстановиться в своих клетках, и не хранится анестезии дольше, чем это необходимо. В нашем личном опыте (неопубликованные данные) мышей, которые держали анестезии непрерывно с помощью вдыхаемого изофлюрана между 0 и 6 часов времени точки показали незначительный зазор. Аналогичным образом, контролируемая доза анестезии также необходима для обеспечения быстрого восстановления. При обеспечении животного к поддону для визуализации, фантомная трубка, используемая для совместной регистрации, должна быть низко на животе, чтобы избежать перекрытия артефактов с легкими. Кроме того, чтобы обеспечить качество КТ-изображения, позаботьтесь, чтобы удалить любые металлические метки с мыши, чтобы избежать артефактов от рентгеновского рассеяния.

Текущий протокол MCC может быть применен к множеству моделей животных. Этот метод оказывает незначительное влияние на здоровье сканируемого животного, хорошо переносится мышами, и из-за этого его можно использовать с моделями заболеваний, не рискуя здоровьем и без того деликатных мышей. Сила этой методологии происходит от него является in vivo техники, которая позволяет для приобретения последовательного и повторяемые измерения функции дыхательных путей без жертвы животных акцизных трахеи для видео-микроскопии, что ex vivo моделитребуют 26. Последовательность этого метода в производстве повторяемых измерений на нескольких сканировании одного и того же животного позволяет рассматривать одно и то же животное с помощью различных агентов или потенциальных терапевтических средств, а также статистические сравнения, сделанные между одним и тем же животным, чтобы уменьшить биологическую изменчивость, присущую любой модели животного, тем самым уменьшая размер выборки, необходимый для того, чтобы показать статистически значимые различия.

Оценка функции дыхательных путей с использованием метода MCC может быть скорректирована на различные модели животных и применяется к различным моделям здоровья дыхательных путей, а также тестирование новых методов лечения. С помощью этой методики можно оценить дыхательные пути мышиных моделей ПХД, а также моделей ХОБЛ. Наш метод также может быть использован для изучения дифференциальных эффектов различных анестезий на MCC, которые находятся в общем клиническом использовании. Наконец, влияние терапевтических средств на дыхательные пути также может быть оценено с помощью этой модели. Как уже говорилось ранее, но несет повторения, так как это измерение in vivo это позволяет повторить оценки MCC в течение болезни, а также тест преимущества терапевтических вмешательств с течением времени. Кроме того, мыши являются наиболее распространенными лабораторными животными, используемыми для имитации/изучения заболеваний человека, при этом в некоторых случаях на выбор можно выбрать несколько трансгенных моделей мышей болезни человека.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

М.З. и K.S.F. и эта работа была поддержана грантом, присуждаемым в рамках Pitt Innovation Challenge (PInCh), через Институт клинической и трансляционной науки при Университете Питтсбурга, и грантом NHLBI R01 HL153407, присужденным М.З.

Materials

500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire Edmund Optics 02-532
99mTechnecium-Sulfur Colloid Cardinal Health
Anesthesia Vaporizer Vetland Medical A13480
Durmont #5 Forceps Fine Science Tools 99150-20
FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software
Introcan Safety Catheters 20G 1inch Fisher Scientific NC1534477
Isoflurane Henry Schein 118-2097
Mouse Intubation Stand Kent Scientific ETI-MSE-01
Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT Siemens
Single Channel Anesthesia Stand Summit Anesthesia Solutions 22860
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Afzelius, B. A. Cilia-related diseases. Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).
  2. Mitchell, D. R. The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles. Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).
  3. Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella. Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).
  4. Randell, S. H., Boucher, R. C. University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).
  5. Wanner, A., Salathe, M., O’Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154, 1868-1902 (1996).
  6. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).
  7. Zahid, M., et al. Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries. PLoS One. 13 (2), 0191605 (2018).
  8. Stewart, E., et al. Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).
  9. Garrod, A. S., et al. Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease. Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).
  10. Harden, B., et al. Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome. Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).
  12. Donaldson, S. H., et al. Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR. JCI Insight. 3 (24), (2018).
  13. Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research. Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).
  14. Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil. Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).
  15. Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 551-558 (2012).
  16. Christopher, A. B., et al. The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia. Frontiers in Pediatrics. 2, 111 (2014).
  17. Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
  18. Lam, H. C., et al. Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).
  19. Bhashyam, A. R., et al. A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model. PLoS One. 7 (9), 45312 (2012).
  20. Ortiz, J. L., et al. Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists. PLoS One. 11 (10), 0164399 (2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Solomon, G. M., et al. Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography. JCI Insight. 2 (5), 91702 (2017).
  23. Nakhleh, N., et al. High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy. Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).
  24. Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs. Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).
  25. Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).
  26. Bhashyam, A. R., et al. Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation. Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).
  27. Van Audenhaege, K., et al. Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging. Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).

タグ

Mucociliary ClearanceIn Vivo EvaluationMiceRadionuclidesSPECT/CT ImagingAnesthesiaIntubationTechnetium Sulfur Colloid3D ReconstructionImage Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Feldman, K. S., Zahid, M. In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (166), e61929, doi:10.3791/61929 (2020).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image