In deze publicatie beschrijven we protocollen voor het beoordelen van luchtwegslijmvliesklaring (MCC) bij muizen in vivo met behulp van dual-modality radionuclide imaging. Dit protocol is ontworpen voor een single photon emission computed tomography (SPECT) en computed tomography (CT) acquisitieprotocol met behulp van muis whole body (MWB) collimators in een dubbel SPECT/CT systeem.
Respiratoire beweeglijke trilharen, gespecialiseerde organellen van de cel, bekleden het apicale oppervlak van epitheelcellen langs de luchtwegen. Door op een metachronale, synchrone manier te kloppen, genereren deze meervoudige, beweeglijke, actine-gebaseerde organellen een cephalad vloeistofstroom die de luchtwegen van geïnhaleerde verontreinigende stoffen en pathogenen vrijmaakt. Met toenemende milieuvervuiling, nieuwe virale pathogenen en opkomende multi-drug resistente bacteriën, cilia gegenereerde mucociliaire klaring (MCC) is essentieel voor het behoud van de gezondheid van de longen. MCC is ook depressief bij meerdere aangeboren aandoeningen zoals primaire ciliaire dyskinesie, cystische fibrose en verworven aandoeningen zoals chronische obstructieve longziekte. Al deze aandoeningen hebben, in sommige gevallen meerdere, muismodellen vastgesteld. In deze publicatie beschrijven we een methode met behulp van een kleine hoeveelheid radioactiviteit en SPECT/CT-beeldvorming met dubbele modaliteit om MCC nauwkeurig en reproduceerbaar te meten bij muizen in vivo. De methode maakt herstel van muizen na beeldvorming mogelijk, waardoor seriële metingen mogelijk zijn en potentiële therapieën in de loop van de tijd in de lengterichting worden getest. De gegevens in wilde muizen tonen de reproduceerbaarheid van de MCC-meting aan, zolang er voldoende aandacht voor detail wordt besteed en het protocol strikt wordt nageleefd.
Trilharen zijn cellulaire organellen op basis van microtubuli die in de evolutionaire geschiedenis van algen tot mensen bewaard zijn gebleven. Ze komen voort uit celoppervlakken en hebben een aantal functies1, variërend van herkenning van lokale omgevingssensorische signalen tot beweeglijkheid, functies die kunnen worden getraceerd van mensen tot vroege eencellige eukaryotische organismen2,3. Trilharen kunnen niet-beweeglijk zijn en dienen als de gespecialiseerde antenne van een cel om omgevingssignalen te verwerken; of beweeglijk en meervoudig, kloppend in gesynchroniseerde, metachronale golven om vloeistofstroom te genereren, zoals in het slijmvlies van de eileiders en de bovenste en onderste luchtwegen, met uitzondering van de terminale bronchiolen die naar de longblaasjesleiden 1,2.
Het uitgebreide epitheeloppervlak van de luchtwegen wordt blootgesteld aan een constante spervuur van verontreiniging in de vorm van een verscheidenheid aan potentieel gevaarlijke geïnhaleerde verontreinigende stoffen en pathogenen, waardoor een verdediging nodig is. Een belangrijk verdedigingsmechanisme is het slijmvliesapparaat van de tracheobronchiale boom, waar een continue stroom van afgescheiden slijm mechanisch uit de luchtwegen wordt getransporteerd door het kloppen van meerdere beweeglijke trilharen langs de apicale oppervlakken van de tracheo-bronchiale epitheelcellen. Deze functie om geïnhaleerde verontreinigingen in de val te lokken, en door hun continue, synchrone afstraffing, transporteren ze cephalad4,5.
Van trilharen is aangetoond dat zij een sleutelrol spelen, zoals bij de ontwikkeling van links-rechts-patronen bij de ontwikkeling van embryo’s, waarbij beweeglijke trilharen bij de embryonale knoop symmetrie breken6. Mutaties in trilharen gerelateerde genen zijn in verband gebracht met ziekten zoals congenitale hartziekte (CHD) als gevolg van de asymmetrische structuur van het hart6. Recente studies hebben een hoge incidentie van ciliaire disfunctie in de luchtwegen van patiënten met CHD gemeld, evenals een verhoogde prevalentie van postoperatieve ademhalingscomplicaties en chronische luchtwegsymptomen in de bovenste en onderste luchtwegen7,8,9,10. Van patiënten met CHD en ciliaire disfunctie, met of zonder heterotaxie, is aangetoond dat zij een verhoogd risico hebben op ademhalingscomplicaties en negatieve ademhalingsresultaten postoperatief5,8,10. Naast hun rol in signalering en ontwikkeling, is het belang van luchtwegcilia aangetoond door ciliopathieën, waarvan een goed voorbeeld primaire ciliaire dyskinesie (PCD) is. PCD is een aangeboren aandoening die het gevolg is van een aantal mutaties die de beweeglijke luchtwegcilia aantasten, wat leidt tot terugkerende longinfecties, bronchiectasis en mogelijk de noodzaak van longtransplantatie11. Bovendien, hoewel trilharen normaal zijn bij cystische fibrose (CF), de meest voorkomende aangeboren aandoening in de Kaukasische bevolking, is MCC aangetast als gevolg van dik, stroperig slijm als gevolg van mutaties in het CFTR-gen12. Er zijn meerdere muismodellen van PCD en CF, evenals een steeds groter aantal modellen CHD. Uiteindelijk zijn trilharen veelzijdige structuren met veel sleutelrollen, en een methode om de functie van beweeglijke respiratoire trilharen in vivo te beoordelen, kan waardevol zijn voor preklinisch onderzoek en het beoordelen van effecten van mutaties en geneesmiddelen op mucociliaire klaring (MCC)13. De methode zou ook waardevol zijn bij het beoordelen van effecten van nieuwe geneesmiddelen, gentherapie of interventies op MCC in deze muismodellen.
Er zijn veel verschillende modellen die zijn gebruikt om MCC te beoordelen. Een opmerkelijke methode omvat het gebruik van methyleenblauwe kleurstof die in de bronchus is ingebracht, met klaring gemeten door fiberoptische meting van kleurstofbeweging14. Deze methode wordt beperkt door het vermogen om de beweging van de kleurstof te observeren, wat meer routine is bij mensen dan in preklinische muismodellen. Een andere opmerkelijke methode is synchrotron fase-contrast röntgenbeeldvorming (PCXI), die kan worden gebruikt om individuele deeltjes in een luchtweg te volgen. Deze methode is relatief nieuw en niet breed toegankelijk15. Er zijn tal van ex vivo methoden om de luchtwegen te beoordelen door een luchtpijp af te snijden voor videomicroscopie, maar deze modellen bieden weinig nut bij menselijke patiënten16. Hoge resolutietechnieken voor trilharing zoals optische coherentietomografie zijn op dezelfde manier beperkt17.
In dit artikel presenteren we een reproduceerbare methode om MCC in vivo te meten die is gebruikt om longklaringen in talloze diermodellen te meten, evenals MCC te bestuderen bij chronische obstructieve longziekte en de effecten van immunosuppressieve geneesmiddelen te beoordelen18,19. Deze methode volgt de klaring van de radiofarmaceutische 99mtechnetium-zwavel colloïde(99mTc-Sc), een onoplosbare deeltjesradiotracer, na instillatie in de longen. Het radionuclide kan vervolgens worden gevolgd met behulp van single photon emission computed tomography (SPECT)18,20. We hebben deze techniek voor het meten van MCC verder verfijnd met behulp van dual modality SPECT en computed tomography (CT) imaging met co-lokalisatie van radio-isotopentellingen naar de longen en het meten van de afname van deze tellingen gedurende 6 uur. Dual-modality imaging, met co-registratie van CT- en SPECT-beelden, maakt een nauwkeurige lokalisatie van stralingstellingen naar onze interesseregio, de longen, mogelijk. Hoewel we de methode voor MCC-meting bij muizen in detail beschrijven, kan het protocol worden aangepast om MCC bij ratten te bestuderen. De collimators moeten worden aangepast, evenals de stralingsdosis. Naar onze mening zijn muis MCC-scans technisch uitdagender vanwege de kleine diergrootte, maar nuttiger dan ratten vanwege het grote aantal gevestigde muismodellen van een aantal menselijke aandoeningen. Bovendien is een grotere steekproefgrootte, vanwege hun lagere kosten en kosten van onderhoud in dierenkolonies, beter haalbaar bij muizen.
De rol van beweeglijke respiratoire trilharen bij zowel ziekte als ontwikkeling blijft evolueren en wordt beter gewaardeerd. Synchroon, metachronaal kloppen van meerdere beweeglijke trilharen op het apicale oppervlak van cellen langs de tracheobronchiale boom genereren cephaladstroom producerende mucociliaire klaring of MCC. MCC wordt gecompromitteerd in ciliopathieën zoals PCD22, verworven ziekten zoals COPD18, en het belang ervan wordt erkend in CHD’s, niet traditioneel beschouwd als ciliopathieën. Recente gegevens hebben aangetoond respiratoire ciliaire dysfunctie bij zowel CHD met heterotaxy23 als zonder heterotaxie7. Van een dergelijke motiele trilharing bleek zich te vertalen in grotere ademhalingssymptomen9 en grotere postoperatieve morbiditeit8. De meeste, zo niet alle, van deze ziekten hebben muismodellen beschikbaar en ons protocol voor het meten van MCC bij muizen is een waardevol hulpmiddel dat kan worden gebruikt om potentiële therapieën te testen.
Diermodellen bieden nut voor het begrijpen van ziekten en de ontwikkeling van therapieën. In vivo dierlijke beeldvorming biedt verder nut met de mogelijkheid om meerdere gegevenspunten van dezelfde dieren te verkrijgen, zonder dat de dieren hoeven te worden geofferd, waardoor onderzoekers het longitudinale verloop van de ziekte en de duur van de behandelingseffecten kunnen volgen. Het muismodel van MCC is in de loop van decennia ontwikkeld door meerdere onderzoekers, aanvankelijk uitgevoerd op beaglehonden met behulp van planaire scintigrafie, een tweedimensionale nucleaire beeldvormingstechniek24. De techniek werd een decennium later aangepast voor gebruik bij muizen, gevolgd door aanpassing aan SPECT-beeldvorming een decennium na die25,26. De ontwikkeling van deze techniek in muismodellen was een belangrijke ontwikkeling in de relevantie van deze techniek, vanwege de beschikbaarheid van meerdere muismodellen van menselijke ziekten zoals PCD waarin de ciliaire functie aanzienlijk wordt gewijzigd. MCC is beoordeeld in muismodellen van longdenervatie en immunosuppressie en kan worden gebruikt in combinatie met andere modellen19,26. MCC-meetstudies bij menselijke patiënten met luchtwegaandoeningen zoals CF, astma, PCD en ciliopathieën geassocieerd met CHD zijn uitgevoerd en hebben resultaten opgeleverd dat de techniek zowel studies naar longfysiologie als therapeutische werkzaamheid kan helpen13.
Een belangrijk onderdeel van dit protocol is het opzetten van acquisities met de juiste beeldparameters om nauwkeurige beelden te verkrijgen voor kwantificering. Een aantal factoren zijn essentieel bij het ontwerpen van SPECT-acquisitie-instellingen, waaronder welke collimators worden gebruikt, het aantal projecties dat per omwenteling moet worden verworven en de grootte van de rotatiestap. Collimatorselectie is een belangrijke factor in de gevoeligheid en resolutie van de overname, en acquisitie-instellingen moeten mogelijk worden aangepast aan de collimator die wordt gebruikt27. Als alternatief, bij het gebruik van grotere dieren zoals ratten, zouden de collimators moeten worden aangepast. Meerdere pinhole collimators zijn bijvoorbeeld gevoeliger, maar er moet op worden gelet bij het selecteren van een stapgrootte om overlappende projecties te voorkomen en ongewenste multiplexing te veroorzaken, wat de gevoeligheid van de acquisitie verder kan verhogen ten koste van enige beeldambiguïteit die reconstructie-artefacten kan veroorzaken25. Reconstructie-instellingen zijn ook de sleutel om kwantificeerbare afbeeldingen te genereren. MAP3D is een veelgebruikt iteratief reconstructiealgoritme en PSF is een veelgebruikt reconstructiemodel. Beide zijn betrouwbaar voor het reconstrueren van afbeeldingen, maar er moet voorzichtig mee worden omgegaan bij het instellen van het aantal iteraties en subsets. Een hoger aantal iteraties zal de rekentijd die nodig is voor de reconstructie verhogen en de kwaliteit van de reconstructie verhogen met afnemende rendementen bij verdere toename.
Om afbeeldingen in ImageJ te kwantificeren, is RawIntDen de ideale meettool om te gebruiken, waarmee de somwaarde van pixels in een selectie wordt uitgevoerd. Bij het kwantificeren van SPECT-gegevens over verschillende long-ROC’s biedt het gebruik van RawIntDen een absolute meting van tellingen en voorkomt het aanpassen van de meting aan het gebied van de ROI, zoals de gemiddelde meting21zou zijn.
Deze techniek heeft een aantal bijbehorende bronnen van fouten waarvan de onderzoeker op de hoogte moet zijn bij het toepassen van deze techniek. Een opmerkelijke confounder is het gebruik van verdovingsmiddelen. Isofluraan is een snelwerkend, geïnhaleerd verdovingsmiddel waarvan de muizen snel herstellen na voltooiing van een overname. Er moet echter op worden gelet dat de muizen voldoende tijd hebben om in hun kooien te herstellen en niet langer verdoofd worden gehouden dan nodig is. In onze persoonlijke ervaring (ongepubliceerde gegevens) toonden muizen die continu werden verdoofd met behulp van geïnhaleerde isofluraan tussen het tijdspunt van 0 en 6 uur verwaarloosbare klaring. Evenzo is een gecontroleerde dosis verdoving ook nodig om een snel herstel te garanderen. Bij het vastzetten van het dier aan de pallet voor beeldvorming, moet de fantoombuis die wordt gebruikt voor co-registratie laag op de maag worden gehouden om te voorkomen dat artefacten overlappen met de longen. Evenzo, om een CT-beeld van hoge kwaliteit te garanderen, moet u ervoor zorgen dat metalen tags van de muis worden verwijderd om artefacten van röntgenverstrooiing te voorkomen.
Het huidige MCC-protocol kan worden toegepast op talloze diermodellen. Deze techniek heeft een verwaarloosbaar effect op de gezondheid van het gescande dier, wordt goed verdragen door muizen en kan daarom worden gebruikt met ziektemodellen zonder de gezondheid van reeds delicate muizen te riskeren. De kracht van deze methodologie komt voort uit het feit dat het een in vivo techniek is, die het mogelijk maakt om consistente en herhaalbare metingen van de luchtwegfunctie te verkrijgen zonder het offer van dieren aan accijnstracheas voor videomicroscopie, die ex vivo-modellen vereisen26. De consistentie van deze techniek bij het produceren van herhaalbare metingen over meerdere scans van dezelfde dieren, maakt het mogelijk om hetzelfde dier te behandelen met verschillende middelen of potentiële therapeutische middelen, en statistische vergelijkingen tussen hetzelfde dier om de biologische variabiliteit te verminderen die inherent is aan elk diermodel, waardoor de steekproefgrootte wordt verminderd die nodig is om statistisch significante verschillen aan te tonen.
De beoordeling van de luchtwegfunctie met behulp van de MCC-techniek kan worden aangepast aan een verscheidenheid aan diermodellen en worden toegepast op veel verschillende modellen van luchtweggezondheid, evenals het testen van nieuwe therapieën. De luchtwegen van muismodellen van PCD kunnen met behulp van deze techniek worden beoordeeld, evenals modellen van COPD. Onze methode kan ook worden gebruikt om differentiële effecten van verschillende anesthetica op MCC te bestuderen die in gemeenschappelijk klinisch gebruik zijn. Tot slot kunnen de effecten van therapeutische middelen op de luchtwegen ook met dit model worden beoordeeld. Zoals eerder vermeld, maar draagt herhaling, omdat het een in vivo meting is, maakt het mogelijk om MCC-beoordelingen in de loop van een ziekte te herhalen, evenals testvoordelen van therapeutische interventies in de loop van de tijd. Bovendien zijn muizen de meest voorkomende proefdieren die worden gebruikt om menselijke ziekten na te bootsen / bestuderen, met in sommige gevallen meerdere transgene muismodellen van menselijke ziekten beschikbaar om uit te kiezen.
The authors have nothing to disclose.
M.Z. en K.S.F. en dit werk werd ondersteund door een subsidie toegekend in het kader van de Pitt Innovation Challenge (PInCh), via het Clinical and Translational Science Institute aan de Universiteit van Pittsburgh, en NHLBI R01 grant HL153407, toegekend aan M.Z.
500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire | Edmund Optics | 02-532 | |
99mTechnecium-Sulfur Colloid | Cardinal Health | ||
Anesthesia Vaporizer | Vetland Medical | A13480 | |
Durmont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software | |||
Introcan Safety Catheters 20G 1inch | Fisher Scientific | NC1534477 | |
Isoflurane | Henry Schein | 118-2097 | |
Mouse Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MSE-01 | |
Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT | Siemens | ||
Single Channel Anesthesia Stand | Summit Anesthesia Solutions | 22860 |