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概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
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生物工学

細胞電微小環境の有限元素モデリング

Published: May 18, 2021
doi:
10.3791/61928
, , , ,
1Department of Materials, Faculty of Science and Engineering,The University of Manchester, 2Department of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, Faculty of Science and Engineering,The University of Manchester, 3The Henry Royce Institute, Royce Hub Building,The University of Manchester

概要

本論文では、電界(EF)に曝露された繊維状導電材料の有限元素モデルを構築するための戦略を示す。モデルは、そのような材料に播種された細胞が受け取る電気入力を推定し、足場の構成材料特性、構造または向きを変更した場合の影響を評価するために使用することができる。

Abstract

臨床研究は、電気刺激(ES)が様々な組織の治癒および再生のための潜在的な治療法であることを示しています。電界に曝露された場合の細胞応答のメカニズムを理解することは、臨床応用の最適化を導くことができる。in vitro実験は、それらを明らかにすることを目的としており、倫理的かつ効果的に評価できるより広い入力および出力範囲の利点を提供します。しかし、インビトロ実験の進歩は、臨床現場で直接再現することは困難です。主に、インビトロで使用されるESデバイスは患者の使用に適したものとは大きく異なり、電極から標的細胞への経路が異なるからである。したがって、in vitro の結果を in vivo プロシージャに変換することは簡単ではありません。我々は、細胞微小環境の構造及び物性が実際の実験試験条件において決定的な役割を果たしていることを強調し、インビトロとインビボの間のギャップを埋めるために電荷分布の尺度を使用できることを示唆する。これを考えて、我々は、シリコ有限要素モデリング(FEM)で細胞微小環境と電界(EF)暴露によって生じる変化を記述するためにどのように使用できるかを示す。我々は、EFが幾何学的構造を持つどのように組み合って電荷分布を決定するかを強調する。次に、時間依存入力が電荷の動きに与える影響を示します。最後に、(i)インビトロ線維化ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)ポリ(スチレンジュルホン酸塩)(PEDOT-PSS)足場と(ii)細胞外マトリックス(ECM)の生体内コラーゲンの2つのケーススタディを用いて、新しいインシリコモデル方法論の関連性を実証します。

Introduction

ESは、生物細胞や組織の制御を目的としたEFの使用です。そのメカニズムは、内部および周囲の生体分子が外部から生成された電圧勾配にさらされたときに細胞に伝達される物理的刺激に基づいています。荷電粒子はクーロンの法則に準拠した組織的な運動に従事し、荷電されていない粒子に抗力を発生させる。得られた流体流量および電荷分布は、細胞が微小環境条件の変化に適応しようとする中で、接着、収縮、移動、配向、分化および増殖1 などの細胞活動および機能を変化させる。

EFは制御可能で、非侵襲的で、非薬理学的であり、必須細胞の挙動に有効な影響を与えることを示すため、ESは組織工学および再生医療にとって貴重なツールです。これは、正常に神経2、骨格3、心筋4、骨5および皮膚6の発達を導くために使用されています。また、イオントフォアシス7を増強するに従って、従来の薬理学的なものに対する代替的または相補的な治療法として用いられる。より高品質の臨床試験が8、9、10を待っているように、疼痛管理におけるその効率はまだ議論されている。それにもかかわらず、副作用は報告されておらず、患者の福祉11、12、13、14、15を改善する可能性がある。

臨床試験のみが、処置の有効性に関する決定的な評決を下すことができるが、インビトロおよびインシリコモデルは、より広範な実験条件に対してより強力な制御を提供するため、予測可能なES治療の設計を知らせる必要がある。ESの調査された臨床使用は、骨再生16、17、脱熱筋18、19、手術後の軸索再生20、21、疼痛緩和22、創傷治癒23、24、25およびイオン刺激性薬物送達26である。ESデバイスがすべての可能なターゲットアプリケーションに広く導入されるには、臨床試験はまだ効率的な治療のためのより強力な証拠を確立していません。生体内動物研究とヒト研究の両方が一貫して肯定的な結果を報告するドメインにおいても、報告された方法の多くは、それらと高い取得価格の間で選択する方法に関するあまりにも少ないガイダンスと相まって、臨床医がESデバイス27に投資するのを妨げる。これを克服するために、標的組織はもはやブラックボックス(インビボ実験の限界)として扱われなくなるが、複数のサブシステムの複雑な相乗効果と見なされなければならない(図1)。

複数のES実験は、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年にわたってインビトロで行われてきた。これらのほとんどは、電極間の電圧降下をそれらの間の距離で割っただけでESを特徴付ける – 電界の大きさの大まかな近似。しかし、電界自体は荷電粒子にのみ影響し、細胞は直接影響を与えない。また、装置と細胞の間に複数の材料が介在する場合、粗近似が保持されない場合があります。

入力信号の特性を高めるには、刺激がどのように細胞に伝達されるのかを明確に把握する必要があります。ESを提供する主な方法は、直接、容量性および誘導性のカップリング35、36である。各方法のデバイスは、電極タイプ(ロッド、平面または巻き)と、ターゲット組織に対する配置(接触または単離)35と異なる。より長い治療のために生体内で使用されるデバイスはウェアラブルである必要があり、したがって、電極およびエネルギー源のほとんどの時間は、創傷包帯または電気活性パッチとして皮膚に移植または取り付けられる。生成された電圧勾配は、処理領域内の荷電粒子を置き換える。

細胞の近傍で得られる荷電粒子流に影響を与えるため、足場構造はESプロトコルの設計において最も重要である。電圧勾配変化に対するプラットフォーム材料、合成技術、構造または向きが変化する場合、異なる電荷輸送構成が生じます。生体内では、荷電粒子の入手可能性と移動は、細胞だけでなく、コラーゲンネットワークおよび支持ECMを構成する間質流体によっても影響を受けます。設計された足場は、vitro1,35で自然な細胞微小環境をより良く再現するためにますます使用されています。同時に、ECMは複雑な自然の足場です。

人工足場は、金属、導電ポリマーおよび炭素に基づいており、電気化学的性能および長期安定性との生体適合性のバランスをとることに焦点を当てて設計される36。汎用性の高い足場タイプの1つは、制御可能なナノスケールの地形を提供するエレクトロスパン繊維状マットです。これは、ECMに似て設計することができ、したがって、組織37の広い範囲の再生を助ける同様の機械的手がかりを提供する。ESに大きな影響を与えるためには、マットがある程度導電性である必要があります。しかし、導電性ポリマーは、絶縁担体とのエレクトロスピンやブレンドが困難であり、得られる繊維38の導電性を制限する。一つの溶液は、誘電性繊維の表面に導電性モノマーを重合し、その結果、最終的な製品38の機械的強度および電気特性が良好になる。例としては、シルクのエレクトロスパン繊維を半導電性PEDOT-PSS39でコーティングする。機械的および電磁的な手掛かりの組合せは、神経突起の成長40、41、42を著しく加速させる。ニューライトは、繊維の整列を足場に従い、繊維に平行なEFに曝露した後、垂直143よりも伸びる。同様に、EFへの線維性足場のアラインメントも、筋形成性成熟33を促進する。

ECMは、線維形成タンパク質44から主に構成され、それらのうち、I型のコラーゲンのうち軟骨(コラーゲンII型が豊富)44を除くすべての動物組織において主要な構成成分である。トロポコラーゲン(TC)は、ポリペプチド鎖の三重らせん立合体、コラーゲンフィブリル45の構造モチーフである。コラーゲン線維の透過電子顕微鏡および原子間力顕微鏡画像は、ホッジ&ペトルスカモデル47によってTCギャップとオーバーラップ45の規則的な配列として説明されたD周期的バンドパターン46を示す。腱は、非コラーゲン性高親水性プロテオグリカンマトリックス48、49によってシールドされた整列したコラーゲン性フィブリラーマトリックスから構成される。デコリンは、コラーゲン線維のギャップ領域を結合し、グリコサミノグリカン(GAG)側鎖49を介して他のSLRPsと接続することができる小さなロイシン豊富なプロテオグリカン(SLRP)である。腱に関する研究は、水和すると電気特性が大きく変化することを示しています50,51,水和レベルが増加するにつれて、電荷輸送機構は原発性からイオン性に変化します51.これは、コラーゲンタイプIフィブリルに沿った電気伝導が、異なる電気伝導性と誘電率を有するギャップと重なり合う領域を有するデコリン水コートによって可能にすることができることを示唆している。

人工足場によるECMの同一のレクリエーションはあり得ないので、翻訳可能な結果によって可能になるin vivoとin vitroの間の相乗効果を生み出す知識は行き止まりにあるように思われる。シリコモデリングでは、両者の間の翻訳を再び可能にするだけでなく、ESに関与する未知のプロセスを特徴付けに重要な利点を追加します。インビボ観測とin vitroを比較すると、標的組織と生物の残りの部分との結合強度に関する情報を得ることができますが、現在の知識限界は明らかにされません。未知は、現在の知識と何が起こるかに基づいて起こることが予想されるのとの違いを観察することによって暴露することができる。数理モデリングに基づくインシリコ実験では、プロセスを既知のサブプロセスと未知のサブプロセスに分割することができます。このように、モデルで説明されていない現象は、インビトロおよびインビボ実験と比較して、インビリコ予測で明るみに出る。

細胞や組織が電界にどう影響を受けるかの基礎となるメカニズムに関する仮説の形成とテストは、別々に検査する必要がある多数のパラメータ52 によって妨げられる。代表的な実験条件を定義するには、ESプロセスをサブプロセスで分割する必要があります (図 1) とセルの動作に影響を与える主要な入力信号を特定する必要があります。細胞に対するESの基本的な物理的効果を表すモデルは、EFと細胞を結び付けるドメインを記述する – 荷電粒子53のそれ。細胞外の粒子の挙動は微小環境に依存し、細胞とは別に調べることができます。セルの主要な入力信号は、セル応答の変動の度合いが最も大きい ES デバイス出力のサブセットです。すべての支配的なセル入力信号のバリエーションを生成できる完全な実験パラメータの最小サブセットを使用して、パラメータ空間の次元とテストケースの数を減らすことができます。

生物学的ES標的モデルの入力は、ESの細胞に対するESの物理的影響を記述するのに有用な、ESデバイスによって生成される出力信号のサブセットである必要があります。直接結合を有する単純なバイオリアクターは、電解電気化学細胞と同じ構造を有する。これらのモデルは、一次(溶液抵抗を考慮する)、二次(ファラディック反応も考慮する)または三次(イオン拡散を考慮した)電流密度分布を示す。複雑さは計算コストに変換するため、最も単純なモデルは、パラメータ空間探査に最も適しています。材料特性54によって動機づけられた繊維状複合材料のシミュレーションは、複雑なマイクロアーキテクチャの結果としてバルク材料特性に焦点を当て、したがってEF露光の局所的な影響を記述することができない。インシリコモデルに存在し、ESによって動機づけられ、生物学的試料に焦点を当て、均質な媒体55、56、57、または均質な細胞外空間58を有する複合組織に浸漬した単一の細胞である。電荷密度と電流密度(図2)は、ESデバイスと生物学的サンプルのモデル間、またはESデバイスの異なるコンポーネント間のインタフェース信号として機能します。提案されたFEMベースのプロトコルは、図2に記載されている方程式を使用し、直接結合設定によって生成されたEFとは無関係に、これらの2つの信号を調節するためにスキャフォールド依存パラメータをどのように使用できるかを研究するために使用されました。結果はESが標的細胞に与える影響を調査する際に、足場またはECM電気的特性を考慮する必要があることを強調する。

Protocol

1. COMSOL でモデルを構築する COMSOL を開き、 [ 空のモデル ]を選択します。 パラメータ: モデル ビルダで[ グローバル定義] を右クリックし、[ パラメータ ]を選択して、 Table 1に従ってパラメータを追加します。 材料: 表 2に従って、プロパティを持つマテリアルを追加します。 [モデル ビルダ] の[グローバル定義] で[マテリアル]を右クリックし、[空の材料]を選択します。 材料特性を追加: 新しく追加したマテリアルの設定で、[ 材料特性]>[基本プロパティ]を展開し、[ 相対導力] を選択して[+]記号を押してプロパティを追加します。 [電気伝導度] の手順を繰り返します。 [ 材料の内容]で 、表 2に従って現在の材料特性を入力します。 コンポーネント定義: 上部リボンの[ ホーム ]タブで、[ コンポーネントを追加 ]をクリックして [3D]を選択します。新しいコンポーネント ノードが モデル ビルダに表示されます。 ジオメトリ: モデルビルダで[ ジオメトリ]を右クリックし、[ 挿入]をクリックして [フルモデル ]をダブルクリックし、適切なシーケンス(SC/SNC/RC/RNC/RNCd)を選択します。 または、下位の手順に従ってジオメトリをゼロから構築します。[ モデル ビルダ] で、現在のコンポーネント ノードの下にある [ジオメトリ ] を左クリックします。同じ ジオメトリ ノードは、次の従属ステップで参照されます。 [設定] ウィンドウで、[長さ]単位を nm に変更し、[単位を変更するときに値を拡大縮小する]がオフになっていることを確認します。 足場の幾何学 モデル ビルダで、[ ジオメトリ ] を右クリックし、[ ブロック] を選択します。 [ 設定] タブで、ラベル「スキャフォールド範囲」を入力します。 サイズと形状を展開し、幅、奥行き、高さの「Ws」、「Ls」、「Hs」を入力します。 [ 位置] を展開し、[ 基準 ] を [中心] に変更します。 [ 結果エンティティの選択] を展開し、[ 新規 ] を選択して [スキャフォールディングの選択] を追加します。 [周囲の物質の範囲]: [モデル ビルダ] の [ ジオメトリ] で、[ スキャフォールディング範囲 ] を右クリックし、[ 複製] を選択して 、[設定] タブを編集します。 ラベルを「メディアエクステント」に変更します。 [サイズとsh a pe] セクションの各ボックスに、存在するパラメータの前に “med_ratio *” を追加します。 [ 結果エンティティの選択] で、[メディア選択] として [新しい選択] を追加します。 ファイバーのジオメトリ(SC スキップ 1.6.6)コア (RC スキップから 1.6.4.2) [ モデル ビルダ] で[ ジオメトリ]を右クリックし、[ 円柱]を選択して、[ 設定] タブを次のように編集します。 ラベルを「コア」に変更します。 [サイズと形状]を展開し、[半径]と[高さ]に「Rc」と「Lf」を入力します。 位置を展開し、x および y の 「超過する *Ws/2」 と “-Lf/2” を入力します。 [軸]を展開し、[軸の種類] を Y 軸に変更します。 結果エンティティの選択を展開し、「コア選択」を追加します。 コート(SNCスキップで1.6.5) スラブ (RC または RNC は 1.6.4.2.2 にスキップします。RNCd は 1.6.4.2.3 にスキップします) [ジオメトリ] の [モデル ビルダ] で、[スキャフォールディング範囲] を右クリックし、[複製] を選択します。ジオメトリ シーケンスのコアの直後に重複(スキャフォールディング範囲 1)が表示されていることを確認します。 [設定]タブで、ラベルを「コート」に変更します。 [設定]タブで、[結果エンティティの選択]を展開し、「ファイバー選択」を作成します。 1.6.5 にスキップします。 同種 モデル ビルダ で[ ジオメトリ]を右クリックし、[ 円柱 ]を選択して、[ 設定] タブを次のように編集します。 ラベルを「コート」に変更します。 [サイズと形状]を展開し、[半径]と[高さ]に「Rf」と「Lf」を入力します。 位置を展開し、x および y の 「超過する *Ws/2」 と “-Lf/2″ を入力します。 軸を展開し、軸のタイプを y 軸に変更します (RC は 1.6.4.2.2.7 にスキップします)。 レイヤーを展開し、厚みの「Rf-Rc」を入力し、「側のレイヤー」のみをオンのままにします。 [結果エンティティの選択]を展開し、”コート選択” を追加するか、RC の場合は “ファイバー選択” を追加します (RC スキップ 1.6.5)。 モデル ビルダで、[ ジオメトリ ] を右クリックし、[ エンティティの削除] を選択します。 [設定]タブで、[ジオメトリエントリレベル]を[ドメイン]に変更し、[選択対象としてコート選択]を選択します。 選択ボックス (階層化された円柱のコア) から、ドメイン 3 以外のすべてのドメインを削除します。 [結果エンティティの選択]を展開し、[コート選択] を選択します。 1.6.5 にスキップします。 2 つの型の周期配列 モデル ビルダで、[ ジオメトリ ] を右クリックし、[ 円柱] を選択します。新しく作成した要素を右クリックし、[ 複製] を選択します。 [設定] タブを次のように編集します。 ラベルを「コート1」/「コート2」に設定します。 半径を Rf に設定します。 高さを「D*プロップ」/「D*(1-プロップ)」に設定します。 位置を拡大し、yのxと”-Lf/2″/”-Lf/2+D*******の両方の「超過分*Ws/2」を記入します。 [軸]を展開し、軸の種類を Y 軸に変更します。 [レイヤー]セクションを展開し、”Rf-Rc” を入力します。[サイドレイヤー]ボックスのみがオンになっていることを確認します。 結果のエンティティの選択を展開し、「コート1選択」/「コート2選択」を作成します。 モデル ビルダで、[ ジオメトリ ] を右クリックし、[ エンティティの削除] を選択します。 [ 設定] タブで 、[ジオメトリエントリレベル] を [ドメイン ]に変更し、グラフィックスウィンドウから円柱2(cyl2)と円筒3(cyl3)を選択します。 選択ボックス (階層化された円柱のコア) からドメイン 3 以外のすべてのドメインを削除します。 [結果エンティティの選択]を展開し、[コート選択]を作成します。 [モデル ビルダ] で[ジオメトリ]を右クリックし、[変換]を展開して[配列]を選択します。[設定]タブを次のように編集します。 入力オブジェクトの「コート選択」を選択します。 配列の種類を [線形] に設定します。 サイズを”Lf/D”に設定します。 y 軸の 変位 を「D」に設定します。 配向ファイバアレイの幾何学 コアアレイ (RC スキップから 1.6.5.2) モデル ビルダで、[ ジオメトリ] を右クリックし、[ 変換を展開 して 回転] を選択します。 [ 設定] タブで 、[入力オブジェクトスイッチ ]をオンにして、ドロップダウン リストから [コア選択 ]を選択します。[入力オブジェクトを保持]ボックスがオフになっていることを確認します。 回転角度を展開し、回転の「θ」を入力します。 結果エンティティの選択を展開し、「ファイバー選択」を作成します。 モデル ビルダ で、[ ジオメトリ] を右クリックし、[ 変換を展開 して 配列] を選択します。 ラベルを「コア配列」に変更します。 [入力オブジェクト] のドロップダウン リストから [コア選択] を選択します。 [ サイズ]を展開し、[ 配列の種類 ] を [線形] に変更し、[サイズ] に 「n_1*(theta45)」 と入力します。 変位を展開し、xとyの「2*tes*Rc*sin(シータ)」を記入します。 結果エンティティの選択を展開し、「ファイバー選択」を選択します。 コートアレイ(SNCスキップで1.6.5.3) モデル ビルダで、[ ジオメトリ] を右クリックし、[ 変換を展開 して 回転] を選択します。 [設定]タブで[入力オブジェクトスイッチ]をオンにし、ドロップダウン リストから[コート選択]を選択します。[入力オブジェクトボックスを保持] がオンになっていません。 回転角度を展開し、回転の「θ」を入力します。 結果エンティティの選択を展開し、「ファイバー選択」を選択します。 モデル ビルダで、[ ジオメトリ] を右クリックし、[ 変換を展開 して 配列] を選択します。 ラベルを「コートアレイ」に変更します。 入力オブジェクトのドロップダウンリストでコート 選択 を選択します。 [ サイズ]を展開し、[ 配列の種類 ] を [線形] に変更し、[サイズ] に 「n_1*(theta45)」 と入力します。 変位を展開し、xとyの「2*tes*Rc*sin(シータ)」を記入します。 結果エンティティの選択を展開し、「ファイバー選択」を選択します。 カット足場 ファイバーを結合: モデル ビルダ で[ ジオメトリ]を右クリックし、[ ブール演算 と パーティション] を展開して、[ ユニオン]を選択します。 ラベルを「ファイバー」に変更します。 [入力オブジェクト]スイッチをオンにして、ドロップダウン リストから[ファイバー選択]を選択します。 [入力オブジェクトを保持する] ボックスがオンになっていません。 「内部境界を維持する」がチェックされていることを確認します。 [結果エンティティの選択] を展開し、ドロップダウン リストから [スキャフォールディングの選択] を選択します。 カットを実行する: モデル ビルダ で[ ジオメトリ]を右クリック し、[ブール演算とパーティション] を展開して、[ 交差]を選択します。 ラベルを「スキャフォールド」に変更します。 [入力オブジェクト]スイッチをオンにして、ドロップダウン リストから[スキャフォールディング選択]を選択します。 [入力オブジェクトを保持する] ボックスがオンになっていません。 「内部境界を維持する」がチェックされていることを確認します。 アンサンブルジオメトリ 周囲の物質ジオメトリを定義します。 モデル ビルダで、[ ジオメトリ] を右クリックし、[ ブール演算とパーティション ] を展開して [ 差分] を選択します。 [設定] タブに進みます。 [追加する オブジェクト] ドロップダウン リストで、[ メディアの選択] を選択します。 [ 減算するオブジェクト] ドロップダウン リストで、[ スキャフォールディング選択] を選択します。 [入力オブジェクトを保持する] と [内部境界を保持] ボックスの両方がオンになっていることを確認します。 [メディアエクステントを削除]ボックス [モデル ビルダ] で、[ジオメトリ] を右クリックし、[エンティティの削除] を選択します。[設定]タブに進みます。 [ジオメトリエントリレベル]ドロップダウンリストから[ドメイン]を選択します。 [ 選択] ドロップダウン リストから [メディアの 選択] を選択 します。 選択ボックスから “dif1” を削除します。 ジオメトリの構築 [ ジオメトリ ] ノードで、[累積選択] ノードの前にある最後の要素が フォームユニオンで、フォーム アセンブリではないことを確認します。必要に応じて、[ フォーム アセンブリ ] を右クリックし、[設定] タブで [アクション] を [結合を形成] に変更します。 モデル ビルダで、左の [ジオメトリ ] をクリックし、[ すべて構築] を選択します。 料 [現在のコンポーネント]ノードの下にあるモデル ビルダで、[材料]を右クリックし、[マテリアル リンク]を選択します。 複雑度レベルに応じて、何倍もの材料が考慮されるように、セクションを 5 回繰り返します。 各成分の材料を次の順序で関連付けます: 周囲の物質、コート、コア。 [ 設定] タブで、[メディア /スキャフォールド (SC、SNC、RC)の場合)/コート/コア選択 ]ドロップダウン リストから選択します。 [リンク設定]を展開し、ドロップダウン リストから適切なマテリアルを選択します。 メッシュ [ モデル ビルダ] で、現在のコンポーネントの下にある メッシュ ノードを左クリックします。 [設定]タブで、[要素サイズ]ドロップダウン リストから[標準] を選択し、左の [すべてビルド] をクリックします。 物理演算: モデル ビルダで、現在のコンポーネントを左クリックし、[ 物理演算の追加] を選択し、[ 物理演算の追加] タブで AC/DC モジュールを展開し、[ 電流 (ec)] モジュール を選択して [ コンポーネントに追加] をクリックします。 境界条件: [グラフィックス ] タブで 、xy ビューを選択します。 [グラウンド]: モデル ビルダで、[ 電流 ] ノードを右クリックし、[ 地面] を選択します。 境界選択の選択スイッチがアクティブであることを確認し、xz 平面に平行な最も高い周囲の物質面を左クリックして、[境界選択ボックス] に境界 5を追加します。 [端子]: モデル ビルダで、[ 電流 ] ノードを右クリックし、[ 端子] を選択します。 境界選択の選択スイッチ がアクティブであることを 確認し、xz 平面に平行な最も低い周囲の物質面を左クリックして、 境界 2 を [境界選択 ボックス]に追加します。 [端子]セクションを展開し、[端子タイプ]ドロップダウンリストで[電圧]を選択します。電圧のV0を記入してください。 必要に応じて複雑さを追加する: 現在のコンポーネントを保存し、ステップ 1.4 に戻って別の複雑なパス(SC/SNC/RC/RNC/RNCd)に従います。 2. シミュレーションの実行 アダプティブ メッシュリファインメント モデル ビルダで、モデル ルート ノードを左クリックし、[スタディを追加]を選択して[スタディを追加]タブを開き、[固定スタディ]を選択して、[スタディを追加]ボタンを右クリックします。 作成した各コンポーネントにスタディ ステップを作成する :[スタディ ノード]で[ ステップ1: 固定スタディ ]を右クリックし、[ 複製]を選択します。 各スタディステップについて、対応するコンポーネントの詳細を含む設定タブを変更します。 物理と変数の選択を展開します。[解決]列では、現在のコンポーネントだけがオンのままにします。 スタディの延長を展開し、[アダプティブメッシュの細分化]ボックスをオンにします。 ジオメトリ内の アダプティブ の横にあるドロップダウン リストから、現在のコンポーネントのジオメトリを選択します。 モデル ビルダで[スタディ 1]を右クリックし、[計算]を選択します。これにより、現在の向き角度を持つすべてのコンポーネントのジオメトリに適合メッシュが生成されます。 方向角度を設定し、定常スタディを実行します。 [ モデル ビルダ] の [ グローバル定義] で[ パラメータ] を左クリックし、パラメータ の θ をシミュレーションに必要な繊維配向角度に変更します。 各コンポーネントについて、モデル ビルダ でコンポーネントのノードを展開し、[ ジオメトリ ] を右クリックして [ すべて構築] を選択します。 モデル ビルダで、アダプティブ メッシュ細分化スタディを右クリックし、[ 計算]を選択します。 モデルビルダでモデルルートノードを左クリックし、[スタディを追加]を選択して[スタディを追加]タブを開き、[ひな形スタディ]を選択して、[スタディを追加]ボタンを右クリックします。 [モデル ビルダ]で、新しく追加したスタディの下で[ステップ 1]を左クリックし、メッシュ選択を展開して、各コンポーネントでアダプティブ メッシュリファインスタディで生成されたメッシュを選択します。 [計算]ボタンを右クリックします。 方向角度、入力信号を設定し、時間依存の調査を行います。 [ モデル ビルダ] の [ グローバル定義] で[ パラメータ] を左クリックし、パラメータ の θ をシミュレーションに必要な繊維配向角度に変更します。 モデル ビルダで、モデルルートノードを左クリックし、[ スタディを追加 ]を選択して [スタディを追加 ]タブを開きます。[ 時間依存スタディ]を選択し、[ スタディの追加 ]ボタンをクリックして[ 設定] タブを次のように編集します。 時間を「範囲(0、(2*パイ/オメガ)/39,2*pi/ω」に設定します。 物理と変数の選択を展開します。シミュレーション コンポーネントの [解決] チェック ボックスのみをオンのままにします。 メッシュ選択を展開し、シミュレーションコンポーネントのメッシュを選択します。他のコンポーネントのメッシュを[メッシュなし]に変更します。 スタディの延長を展開し、[アダプティブメッシュの細分化]ボックスをオンにします。ドロップダウン リストからシミュレーション コンポーネントのジオメトリを選択します。 時間依存境界条件を定義します。 現在のコンポーネントノードで [定義 ]を右クリックし、[ 関数] の下で 波形を選択します。 [設定]タブで、[関数名]を「入力」に変更します。 [ パラメータ]を展開 し、[タイプ] を [正音]に設定し 、角度周波数 を “ω” に設定し、[ 振幅] を V0 に設定します。 シミュレーションコンポーネントの場合は、 その[電流 ]ノードで 端子 を選択し、電圧を「入力(t[1/s])」に変更します。 [計算]ボタンを右クリックします。 3. 分析 電荷密度 モデル ビルダ で [結果] ノードを右クリックし 、[3D プロット グループ ]を選択して 、[設定]を編集します。 ラベルを「電荷密度」に変更します。 [データ]を展開し、[データセット] ドロップダウン リストでパラメトリックスタディデータセットを選択します。 [色の凡例] を展開し、[凡例を表示] と [最大値と最小値を表示] をオンにします。 モデルビルダの結果ノードの下の[電荷密度]を右クリックし、[ボリューム]を選択します。「設定」タブの編集に進みます。 [データ]を展開し、[データセット] ドロップダウン リストから [親から] を選択します。 式を展開し、[式] ボックスの [ec.rhoq] を入力します。 [範囲]を展開し、[手動カラー範囲] チェックボックスをオンにします。 最小値を「-0.03」に設定し、最大値を「0.03」に設定します。 [色分けとスタイル] を展開し、[色分け] を[色] テーブルに設定し、[色の凡例]ボックスをオンにして 、[色の範囲をシンメタイズする] をオンにします。 モデル ビルダでボリューム を右クリックし、[ フィルタ] を選択します。 [ 設定] タブで、包含する論理式の “abs(ec.rhoq)>0.012″ を入力します。 [印刷]ボタンを左クリックすると、グラフィックス ウィンドウで結果が表示されます。 電流密度 モデル ビルダ で [結果] ノードを右クリックし 、[3D プロット グループ ]を選択して 、[設定] タブを編集します。 ラベルを「電流密度」に変更します。 [データ]を展開し、[データセット] ドロップダウン リストでパラメトリックスタディ データセットを選択します。 [ 色の凡例] を展開し、[凡例の表示] および [最大値と最小値の表示] をオンにします。 モデルビルダの結果ノードの下の[現在の密度]を右クリックし、[矢印ボリューム]を選択します。「設定」タブの編集に進みます。 [データ]を展開し、[データセット] ドロップダウン リストから [親から] を選択します。 式を展開し、”ec.Jx”、”ec.Jy”,”ec.それぞれ x、y、z の各成分の式ボックスの Jz” 。 矢印の位置を展開し、すべての座標の点数を 20 に入力します。 [色分けとスタイル] を展開し、[矢印の長さ]を[正規化済み] に設定し、[スケール係数] をオンにして、85 に設定します。 モデル ビルダで[矢印ボリューム] を右クリックし、[色式] を選択します。 [ 設定] タブで、[式] ボックスに “ec.normJ” と入力します。 [ 色分けとスタイル] を展開し、[ 色 テーブル] を [トラフィック] に設定し、[ 色の凡例 ] と [反転色のテーブル] をオンにします。 [印刷]ボタンをクリックして、グラフィックス ウィンドウで結果を視覚化します。

Representative Results

提案されたモデルは、平行な繊維を有する複合マットの特徴を記述し、導電性物質に浸漬し、外部から生成された電位勾配にさらされる。シミュレーションは、足場の異なる成分を考慮することがマイクロスケールで重要であることを示し、EFへの繊維の位置合わせ角度(入力信号)の変化が、ファイバ付近の電流密度と電荷密度(出力信号)の変動性をどのように生み出すことができるかを探ります。 5つの異なる幾何学的複雑性段階が提示され、それぞれがシミュレーション結果に影響を与える:滑らかな導電性スラブ(SC)、非導電性埋め込み繊維(SNC)を有する滑らかなスラブ、粗い導電性複合材料(RC)、非導電性埋め込み繊維(RNC)を用いた粗い複合材料、非導電性埋め込み繊維を用いた粗い複合材料(RNCd)(図3)プロトコルのセクション 1.5 では、プロジェクト内のジオメトリをインポートする手順を示し、セクション 1.6 では、これらのステップを段階的に構築する方法を示します。最初の 2 つのモデルは、サーフェスの形態を考慮していません。SCおよびRCは、ファイバコア誘電特性を考慮していません。RNCはナノ繊維性人工足場の提案モデルであり、RNCdはECMセグメントの提案モデルである。 計算コストの最小化は、ESデバイスのジオメトリを微小環境を表すモデル単位の体積に縮小することによって達成された。 ESデバイスと足場の幅と長さは数センチメートルの順序で簡単にすることができますが、含まれている繊維の直径は通常ミクロンよりも低いです。ここでは、繊維径に匹敵するスキャフォールドカットを使用して、アスペクト比によって誘導される計算コストを削減し、足場の繊維状性が電気微小環境に及ぼす影響を強調する。ESデバイスの残りの部分は、電界の大きさの大まかな近似が100V / m、頻繁に報告された刺激パラメータになるように選択された電位境界条件に置き換えられます。さらに、 図3 に示す5つの並列繊維を有する単位体積は、平面繊維マット全体を代表するものと見なされます。1D アレイでは、内部の中央(足場の縦対称平面が半分に分割)、内部一過性(他の繊維に囲まれた側表面が非対称的な面)、および外装(足場の端)の3種類の繊維を区別できます。5 は、定義された 3 つのタイプすべてを含めるために必要な最小数のファイバーです。 モデルメッシュ要素サイズはシミュレーション結果に影響を与える可能性があるため、重要な効果を公開できないため、特別な注意が必要です(図4)。これは有限要素法の一般的な規則であり、ナイキストシャノンのサンプリング定理を意味します。本質的なシミュレーション信号が空間で変動する速度が速いほど、メッシュ要素が小さいほど、この現象の忠実な表現を生成する必要があります。一方、要素が小さいほど、モデルの構成要素の総数と計算コストが大きくなります。セクション 2.1 で設定されたアダプティブ メッシュリファインメントは、この操作が大きな変化を生じる場合にのみ要素サイズを小さくすることによって、反対の目的のバランスを取る優れた簡単な方法です。 単純すぎるモデルは、重要な効果を示す失敗する可能性があります (図 5、6)。シミュレーションは、表面形態と足場成分の電気特性を考慮することは、電気微小環境の予測において冗長ではないことを示しています。表面形態は静止したEFに直接影響を与える(SCおよびSNCをRC、RNCおよびRNCdと比較する)が、RCとRNCの予測の比較は、非導電性繊維コアがこの効果を増幅することを示している。ナノ繊維スキャフォールド上の細胞電気微小環境のモデル化の観点から、SC、SNCおよびRCモデルは、このように最適ではない。ただし、異なるステージ間の比較によって、どの機能が特定の効果を生み出すのかを示す助けとなるため、徐々に複雑さを増すことをお勧めします。 モデルの複雑さは、EF にファイバの位置合わせによって電流と電荷密度の変化に影響を与えます。 提案されたプロトコルは、効果を強調するのに役立ちます(図5,6)。SCモデルは、電位勾配への位置合わせが変更された場合、提案されたメトリックにばらつきはありませんが、RNCモデルシミュレーションは、EFに整列した繊維を持つマットユニットと垂直なファイバーを持つマットユニットとの間の強力なコントラストを予測します(図7)。非導電性コアが電流の流れの邪魔になると、周期的なダムが形成され、高電荷密度と低電荷密度の交互領域につながります。 ダイナミックESレジームは、時間依存の研究でシミュレートすることができます。 補足ファイルのビデオは、電気電位勾配に平行または垂直な繊維を持つ完全な人工足場モデル(RNC)上の副弦波入力電圧に対して行われた予測を示しています。EF の大きさが小さくなるにつれて、スキャフォールディングから電荷が放出されると、EF に垂直な繊維に沿った小さな電流が現れます。これは、外部 EF が存在している間だけでなく、切断された直後にも刺激が発生する可能性があることを示しています – ビデオの補足ファイルを参照してください。 図1:モデリングの階層ブロック図 – in vivoおよびシリコモデルでのモデリングの利点と限界 ブロック カラー は、同じ階層レベルのブロックをマークします。下位ランクブロックは、上位ランクのブロックに含まれています。ブロックストロークのカラーマークは、特定のタイプのモデルにブロックを含める可能性があります – 他のシステムブロックとの結合は、インビトロモデルのコンポーネントではないため、ストロークに黄色を持っていません。弾丸はバルブのように機能し、ブロックの制御可能性を示します。バルブがオンの場合、信号は、ストローク内のバルブの色を持つ従属サブシステム内のすべての矢印パスを通過できます。図の解釈:ESプロセスは、刺激装置と生物学的標的で構成され、それぞれが生体内またはインビトロで分離することができないいくつかの相互接続された決定論的または確率的サブプロセスを有し、したがって、それらは赤または黄色の弁を有さない。確率的プロセスは、シミュレーションデバイスと生物学的サンプルの両方が刺激される際の界面にも介入します。インビトロモデルは、目的のシステム(すなわち、皮膚セグメント)を残りの生物から切り離す。したがって、異なる性質の確率過程によって覆われた関心系の組み込みプロセスのみが観察できる。しかし、関連する異なる組み込みプロセスを刺激し、別々に識別することはできません。インシリコモデルは既知の成分のパラメトリックであり、特定の外挿に信用を与える機械論的な理由がないため、その挙動は特定の形状であり、未知の場合は非パラメトリックであると予想される。インシリコ成分はすべて別々に、または異なる組み合わせでシミュレートすることができ、異なる仮説の描写を可能にする。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図2:(A)クーロンの法則(B)電界電位(C)電流(D)電荷密度(E)電流密度(F)連続性(G)電荷保全法の方程式(A) 電荷を帯びた静止粒子qとQは、クーロンの力によって静電気的に相互作用 する。 (B1) 各荷電粒子Qは、宇宙のすべての位置で電位と呼ばれるスカラーフィールド を生成します: .別の荷電粒子qをその位置から移動するために必要な最大の作業 は、電荷qと位置でQによって生成される電位との間の製品です 。複数のパーティクルによって生成される電位電位フィールドは、個々のパーティクルによって生成されるフィールドの合計です。(B2) 固定発生器粒子qおよびQを有する静止場は、 正の電荷qpを有するプローブ粒子に対して作用する。これに対して、qp は位置の電位を最小にするために動く。qpの動きを記述するために、電 位場から電界を導き出すことができます 。 (C) 静止した電界で均一に放出された複数の移動式正荷を受けたプローブ粒子は、組織化された動きに従う。すべての粒子を追跡せずに電荷構成を追跡するには 、(D) 粒子によって空間がどのように占有されているか、 ガウスの法則に従って各無限大体積に電荷密度を割り当て 、(E) 粒子が隣接する無限大体積間の境界面を通過する方法を指定し、 オームの法則に従って各境界に電流密度を割り当てます。 (F) 電荷と電流密度は連続性の方程式に従って共に進化し、不均一な粒子変位は、特定の体積における粒子の蓄積または損失につながる。 (G) 単離されたシステム内では、チャージ保護法が優先され、荷電粒子の流入や流出はありません。 使用される表記法:- q,Q,qp 電荷と荷電粒子の名前; – 位置ベクトルのユークリディアンノルム;k – クーロンの定数; – 勾配演算子、ε- 培地の絶対導電率。σ – 媒体の導電性。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:繊維状マットの5つの異なるレベルの複雑さ- 導電性の埋め込み繊維で滑らかで、最も単純なモデル、表面形態や構成成分の異なる特性を考慮していない。 SNC- 非導電性の埋め込み繊維と滑らかに。 RC- 導電性の埋め込み繊維でラフ、表面形態を説明するが、異なる成分特性のためではありません。 RNC- 非導電性埋め込み繊維とラフ、ナノ繊維性人工足場の完全な提案モデル; RNCd- 2つの異なる材料でコーティングされた非導電性の埋め込み繊維でラフ、コラーゲン繊維のシートのための完全な提案モデル。使用される長さの単位:ナノメートル。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図4:シミュレーション後のアダプティブメッシュリファインメントと結果の電荷密度の結果の例( 左)余分な粗い四面体要素を持つメッシュを自動的に生成しました。(右)静止した調査の間に適応的に精製された最初のメッシュ;シミュレートされた信号が急激な空間変化を持つ領域で正確な結果を得る場合は、より小さな要素が必要です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図5:電位勾配への繊維配向角度は、十分な複雑さを考慮すると、周囲の細胞培養媒体におけるEFの強度に影響を与える。 SC、SNC、RC、RNC、RNCd は、 図 3に示す繊維状マットモデルの複雑さの異なるレベルです。縦軸は、繊維の位置合わせ角度を電位勾配にマークします。抽象的な電極は特色にする – 高い電位と低い電位と上側の下側。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図6:電 位勾配 に対する繊維配向角度は、十分な複雑さを考慮した場合 に周囲の細胞培養媒体における空間電荷密度 に影響を与える。 SC、SNC、RC、RNC、RNCd は、 図 3に示す繊維状マットモデルの複雑さの異なるレベルです。縦軸は、繊維の位置合わせ角度を電位勾配にマークします。抽象的な電極は 特色にする – 高い電位と 低い電位 と上側の下側 。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図7: 電荷の動きは、EFに対する足場繊維の位置合わせの影響を受ける。 両パネルは、安定状態のRNCモデル予測を示す。左側のファイバーは EF と平行で、右側は垂直です。明るい赤から青の色のボリュームは、電荷密度をマークし、矢印ボリュームは、現在の密度の向きをマークします。矢印の色は現在の密度基準に対応 しています。 名前 表現 形容 Ws 10*Rc*med_ratio 足場の幅 Ls 10*Rc*med_ratio 足場の長さ Hs 2*Rf 足場の高さ med_ratio 1.5 スキャフォールドに対する比率細胞培養培地 Rc 278.5[nm] ファイバコア半径 r 1.5 繊維コア対コート比 Rf Rc*r コート半径付きファイバー シータ 90[デグ] 繊維配向角度 Lf 1.3*(Ls*cos(テタ)+Ws*sin(テタ)) 繊維長 テス 1 繊維間距離に対する比率ファイバコア半径 n_1 2*(((Ws/(2*cos(シータ)-Rf)/(2*テス*Rc))+3)*(コス(テタ)!=0)+1*(コス(テタ)==0) ta の場合のファイバーの最大数<=45 n_2 2*((Ls/(2*sin(シータ)-Rf)/(2*tes*Rc))+3)*(sin(シータ)=0)+1*(sin(テタ)==0) thetaの場合の繊維の最大数>45 過剰 1.2+0.3*腹筋(罪(2*テタ)) スキャフォールドからの最初のファイバ相対オフセット D Lf/5 コート周期性 支柱 0.46 周期性Dに対する最初のコートの長さ E 100[mV/mm] 電界の大きさ V0 E*Ls*med_ratio 端子電圧 オメガ 500[Hz] 時間依存試験 電圧周波数 p_sigma 0.5 第2コーティング相対伝導性 p_eps 1.5 第二被覆相対誘電率 表1:シミュレーションに使用するパラメータ カルチャーメディア ペドット:PSS 1 ペドット:PSS 2 コラーゲンハイドレート1 コラーゲン水和2 シルクフィブロイン コラーゲンドライ 電気伝導率(S/m) 1.7014 1.00E-01 p_sigma * 0.1 2.00E-05 p_sigma * 2e-5 1.00E-08 2.50E-08 相対導力 80.1 2.2 p_eps * 2.2 9.89 p_eps * 9.89 7.81E+00 4.97 表 2: シミュレーションで使用される材料特性 補助ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

提案されたプロトコルは、天然および人工足場のための均一なモデリングソリューションを示唆し、そのような材料に播種された細胞に対するEFの影響を検査する際に繊維足場のナノ構造を考慮する必要性を強調する。EF強度の粗い近似(電極間の距離で割った電極電位差)は、100 mV/mmのフィールド強度を期待することにつながりますが、シミュレーションはマットの異なる領域で最大30%高い定常電界強度を予測します(図5)。細胞死は強すぎるEFによって引き起こされる可能性がありますので、この結果はES実験設計とデータ解釈に関心を持つはずです。電気的な微小環境を暴露することは、ESと細胞の発達との間の直接的な相関関係を可能にするであろう。いくつかの研究は、使用された足場33、43、59の詳細な形態解析を提示するが、それらは、構造、材料の電気的特性とEFの間の相互作用を調査していない。このプロトコルは、ファイバー半径、コーティング層の厚さ、繊維間の距離、およびコンポーネント材料の電気特性などのパラメータとして、このリンクを可能にし、ステップ1.2および1.3でグローバル定義を変更することにより、各実験に従って変更することができます。したがって、カスタマイズされた3D空間的に解決された電荷と電流密度予測は、静的ESレジームとダイナミックESレジームの両方に対して行うことができます。

スキャフォールド設計の最適化は、提案された形態やそれらの一部をスケーリングし、広いパラメータ範囲の探査を持つRNCおよびRNCdモデルを介してターゲットにすることができます。また、他のスキャフォールド構成は、セクション 1.6.5 で配列タイプを線形から 3 次元に変更し、セクション 1.6.2 のスキャフォールド ジオメトリを適応させることによって、提案されたプロトコルで調査できます。ただし、目的がなければスキャフォールドの最適化はできません。組織工学の目的のために、主な焦点は細胞の運命であるが、その信頼できる制御が望まれるならば、その主な決定要因である刺激に関するより明確な画像が不可欠である。電荷と電流密度は、EFとECMなどの複雑な足場の異なる成分材料の電気特性との相互作用を示すため、細胞電気微小環境の良好な記述子です。このプロトコルは、ナノ繊維スキャフォールド幾何学を与えられたこれらのメトリックの予測を計算する方法を示し、EFとの繊維の位置合わせ角度の重要性を強調する。電荷と電流密度の予測は、細胞の発達にリンクすることができ、したがって、足場とES体制は、特定のタスクのために最適化することができます。

興味深いことに、研究は、EF露光が平行アライメント60を有するフィルムと比較して、外部EFに垂直なナノファイバーを有する複合フィルムにおいて2倍以上の強度の機械的ストレスを発生させたことを示している。報告された機械的ストレスは、大まかなモデルシミュレーション(RC、RNC、RNCd)によって予測される荷電繊維間で作用するクーロン力の結果である可能性があります(図6)。これらのシミュレーションはこの仮説を調査する上で有用であるが、報告された実験結果は容量結合を有するシステムで得られ、シミュレーションは直接結合を示す。

セルラー入力信号を推定するプロトコルの将来の使用に対する制限要因は、パラメータの不確実性です。幾何学的な不確定なパラメータは、コーティング層の厚さと繊維コア間の距離です。最初のものは、実験的に検証できるバルクインピーダンスにつながる値を見つけることによって推測することができます。2つ目は、高解像度の材料スキャンから抽出できます。材料の物性を説明するパラメータも、不確定性の影響を受けます。しかしながら、例示した材料の電気伝導性と誘電率は、実験測定精度よりもはるかに異なる(表2)。したがって、報告された効果は、中程度の測定誤差にもかかわらず維持されます。

結果は、モデルの複雑さが十分でない場合に、関連情報が隠れる可能性を示しています。このプロトコルは、電荷輸送に影響を与えることができるプロセス-導体(電極)、半導体(コーティング)、誘電体(繊維コア)および電解(周囲物質)に関与する材料の異なる性質を考慮していないため、発生する物理的現象の単純化されたバージョンをシミュレートすることが重要です。この問題は、インターフェース(ファラディック反応)および電解質内のイオン輸送遅延にエネルギー伝達遅延を追加することで、将来のモデル拡張で説明することができます。しかし、観察されたもののほとんどを再現する単純なモデルは、情報をほとんど追加しないが、多くの構成要素パラメータの不確実性に深く敏感である非常に正確なものよりも有用であるため、複雑さを追加することは実験的な検証によって導かれるべきである。

組織工学の最終目標は、生体内環境の1つまたは2つの側面を模倣するだけでなく、すべての細胞発生手がかり61を複製および制御するバイオリアクターを作成することであるとして、インシリコモデルの電磁および機械的ならびにバイオリアクター成分間の熱伝達モデルを組み合わせる必要がある。その後のモデリング段階では、オーム加熱、電解液流、電気刺激60 および圧電62 に応答した形態学的足場変形などの相互作用間の結合現象も加えることができる。ただし、モデルは、各モデルが実験的に検証された後にのみマージする必要があります。このようにして、細胞微小環境における各成分の影響と、刺激の最適化方法について、より良い理解を得ることができます。

提案されたモデルが実験的に検証された場合、それは生物学的細胞のモデルと組み合わせることができます – 図1.電荷密度パターンおよび変調は、特定のイオンポンプの活性に非対称的に影響を与え、膜接着63 を駆動するタンパク質の繊維へのアタッチメントに影響を与え、したがって移行、増殖パターンおよび形態形成64を導く。これらの仮説を探求することは、ESに対する組織および細胞応答を支えるメカニズムを理解する上で前進する方法である。

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、定量・生物物理学生物学における4年間のウェルカムトラスト博士課程プログラムによって支えられたものです。

Materials

Comsol multiphysics 5.2 AC/DC module COMSOL – FEM modelling software
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Verdes, M., Disney, C., Phamornnak, C., Margetts, L., Cartmell, S. Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment. J. Vis. Exp. (171), e61928, doi:10.3791/61928 (2021).
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