Apresentamos um método especificamente adaptado para a imagem de todo o cérebro da Drosophila adulta durante o comportamento e em resposta a estímulos. A cabeça está posicionada para permitir acesso óptico a todo o cérebro, enquanto a mosca pode mover suas pernas e antenas, a ponta do proboscis, e os olhos podem receber estímulos sensoriais.
Apresentamos um método desenvolvido especificamente para a imagem de todo o cérebro de Drosophila durante comportamentos contínuos, como a caminhada. A fixação e dissecção da cabeça são otimizadas para minimizar seu impacto no comportamento. Isso é conseguido pela primeira vez usando um suporte que minimiza os obstáculos de movimento. A parte de trás da cabeça da mosca é colada a este suporte em um ângulo que permite acesso óptico a todo o cérebro, mantendo a capacidade da mosca de andar, noivo, cheirar, saborear e ver. A parte de trás da cabeça é dissecada para remover tecidos no caminho óptico e músculos responsáveis pelos artefatos de movimento da cabeça. O cérebro de mosca pode ser posteriormente imageado para registrar a atividade cerebral, por exemplo, usando indicadores de cálcio ou tensão, durante comportamentos específicos, como caminhar ou aliciamento, e em resposta a diferentes estímulos. Uma vez que a dissecção desafiadora, que requer uma prática considerável, tenha sido dominada, essa técnica permite registrar conjuntos de dados ricos relacionando toda a atividade cerebral a respostas de comportamento e estímulo.
A atividade cerebral por imagem usando várias técnicas aprofundou a compreensão da função cerebral. Em humanos, as técnicas de imagem cerebral têm limitações importantes: enquanto a ressonância magnética funcional (fMRI) oferece resolução espátula-temporal muito abaixo da resolução de neurônios únicos, técnicas rápidas como a eletroencefalografia (EEG) só permitem acesso indireto e parcial ao cérebro1. Em modelos animais suficientemente grandes, como roedores, o registro de sensores de atividade fluorescente (por exemplo, GCaMP) usando microscópios montados na cabeça permite observar a atividade cerebral enquanto o animal está se movendo em seu ambiente2. No entanto, essas técnicas atualmente dão acesso apenas a uma pequena parte do cérebro. Animais com fixação da cabeça podem ser imagens de forma mais abrangente, mas a cobertura ainda é parcial (por exemplo, a superfície do córtex3). É apenas em animais pequenos, como as larvas de zebrafish, C. elegans e Drosophila que todo o cérebro pode ser imageado com resolução temporal e espacial ao nível ou próximo de neurôniosúnicos 4.
D. melanogaster é particularmente promissor porque tem sido usado há muito tempo como um organismo modelo genético5 e poderosas ferramentas genéticas foramdesenvolvidas 6. Complementada pela nova rede anatômica em larga escala derivada da microscopia eletrônica7,a mosca poderia fornecer oportunidades únicas para estudar dinâmicas cerebrais complexas geradas em uma rede de grande escala8. Embora a cutícula não seja transparente e, portanto, deve ser removida para imagem do cérebro, a imagem funcional in vivo tornou-se cada vez mais comum desde o primeiro estudo em 20029 e vários protocolos já foram publicados. No entanto, esses métodos envolvem separar a cabeça de mosca do corpo10,restringindo severamente os movimentos e/ou respostas da mosca aos estímulos11,12,13,14,15, ou apenas permitindo um pequeno parte do cérebro a ser imageado9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. Para complementar essas abordagens, no entanto, poderosas, desenvolvemos recentemente uma preparação para imagem de todo o cérebro durante o comportamento e respostas a vários estímulos28.
Aqui, baseamos neste estudo para apresentar um método especificamente desenvolvido para imagem de todo o cérebro enquanto a mosca executa comportamentos seminat naturalistas (ou seja, caminhada e preparação) e responde a estímulos sensoriais. Isso é conseguido usando um suporte de observação projetado para dar acesso a todo o cérebro a partir do lado dorsal-posterior, deixando as antenas e proboscis intactas, e permitindo que a mosca mova suas pernas para andar (por exemplo, em uma bola amortecida a ar). Os passos para dissecar a parte de trás da cabeça foram refinados para velocidade, reprodutibilidade e para minimizar seu efeito sobre a viabilidade e mobilidade da mosca.
Drosophila é um dos raros animais adultos onde todo o cérebro pode ser imagen durante comportamentos complexos. Aqui, apresentamos um método para preparar a mosca e expor todo o seu cérebro à imagem de toda a atividade cerebral. Vários pontos importantes devem ser observados.
Dissecar um pequeno animal como D. melanogaster é um desafio. O método, portanto, requer muita prática e paciência para dominá-lo. No entanto, após o treinamento, o procedimento leva menos de 30 minutos e produz resultados reprodutíveis.
O método que apresentamos tem limitações adicionais. Primeiro, inclinar a cabeça de mosca de sua posição natural leva ao alongamento do pescoço que pode ser prejudicial ao tecido conjuntivo, nervos ou músculo. Em segundo lugar, embora a zona subesofágica ventral (SEZ) seja opticamente acessível, está abaixo do esôfago semitranspar transparent, o que diminui a intensidade e a resolução nesta área. Finalmente, embora o titular esteja fora de alcance na maioria das direções, a mosca ainda às vezes percebe sua presença e empurra sobre ele para tentar escapar.
Apesar dessas limitações, os dados abrangentes obtidos de imagens cerebrais inteiras durante o comportamento e respostas a estímulos permitirão decifrar a função cerebral ao nível de toda a rede quando o animal interagir e navegar em ambientes complexos e naturalistas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Heidi Miller-Mommerskamp por ajuda técnica e Iveth Melissa Guatibonza Arevalo por comentários úteis sobre o manuscrito. Versões iniciais do protocolo foram desenvolvidas no laboratório de Ralph Greenspan. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG), em particular por meio de uma bolsa FOR2705 (TP3) ao IGK, e pela Fundação Simons (Aimon – 414701) e pelo Instituto Kavli para Cérebro e Mente (número de subvenção #2017-954) recebido pela SA.
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |