우리는 행동 도중 그리고 자극에 응하여 성인 Drosophila의 전체 두뇌를 이미지하기 위하여 특별히 조정된 방법을 제시합니다. 머리는 전체 뇌에 광학 액세스를 허용하기 위해 배치되며, 비행은 다리와 안테나, 프로보시스의 끝을 움직일 수 있으며 눈은 감각 자극을받을 수 있습니다.
우리는 걷기와 같은 지속적인 행동 도중 Drosophila 두뇌 전체를 이미지하기 위하여 특별히 개발된 방법을 제시합니다. 헤드 고정 및 해부는 동작에 미치는 영향을 최소화하기 위해 최적화되어 있습니다. 이것은 먼저 이동 장애를 최소화하는 홀더를 사용하여 달성됩니다. 플라이 의 머리 의 뒷면은 산책, 신랑, 냄새, 맛과 볼 수있는 비행의 능력을 유지하면서 전체 뇌에 광학 액세스를 할 수있는 각도로이 홀더에 붙어있습니다. 머리의 뒷면은 머리 운동 유물을 담당하는 광학 경로 및 근육의 조직을 제거하기 위해 해부됩니다. 플라이 뇌는 칼슘 이나 전압 지표를 사용 하 여 뇌 활동을 기록 하기 위해 이후 이미지를 수 있습니다., 예를 들어 칼슘 또는 전압 지표를 사용 하 여, 걷기 또는 그루밍 등 특정 행동 하는 동안, 그리고 다른 자극에 대 한 응답. 상당한 연습을 필요로하는 도전적인 해부를 마스터한 후,이 기술은 행동과 자극 반응에 전체 뇌 활동과 관련된 풍부한 데이터 세트를 기록 할 수 있습니다.
다양한 기술을 사용하여 뇌 활동을 이미징하는 것은 뇌 기능에 대한 이해를 심화시켰습니다. 인간에서, 두뇌 화상 진찰 기술은 중요한 한계가 있습니다: 기능적인 자기 공명 화상 진찰 (fMRI)는 단 하나 신경 해상도의 훨씬 더 낮은 spatio 측두성 해상도를 제공하지만, 뇌전도 (EEG)와 같은 빠른 기술은 뇌1에간접적이고 부분적인 접근을 허용합니다. 설치류와 같은 충분히 큰 동물 모델에서는, 헤드 마운트 현미경을 사용하여 형광 활성 센서(예를 들어, GCaMP)의 기록은 동물이 그 환경에서 움직이는 동안 뇌 활동을 관찰할 수 있게 한다2. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 기술은 현재 뇌의 작은 부분에 만 액세스를 제공. 머리 고정 된 동물은 보다 포괄적으로 이미지 될 수 있지만, 커버리지는 여전히 부분 (예를 들어, 피질 표면3). 제브라피시 애벌레, C. 예르간과 드로소필라와 같은 작은 동물에서만 전체 뇌가 단일 뉴런4의수준에서 시간적 및 공간 해상도로 이미지화될 수 있다.
D. 멜라노가스터는 오랫동안 유전적 모델유기체5로 사용되어 왔으며 강력한 유전적 도구가6로개발되었기 때문에 특히 유망하다. 전자 현미경 검사법 7에서 파생된 새로운 대규모 해부학네트워크7에의해 보완된, 플라이는 대규모 네트워크8에서생성된 복잡한 뇌 역학을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공할 수 있었다. 큐티클은 투명하지 않고, 따라서 뇌를 이미지하기 위해 제거되어야하지만, 생체 내 기능 적 이미징은 2002 년 첫 번째 연구 이후 점점 더 일반적인 장소가되었다9 여러 프로토콜은 이미 출판되었습니다. 그러나, 이러한 방법은몸(10)으로부터플라이 헤드를 분리하고, 플라이의 움직임을심각하게 제한하고,자극(11,12,13,14,15)또는 뇌의 작은 부분만9,16, 26,26,27,17, 18,18,20,20, 20, 20, 20, 20, 20, 20, 20을포함한다. 이러한 강력한 접근 방식을 보완하기 위해, 우리는 최근에 다양한 자극(28)에대한 행동과 반응 중에 전체 뇌를 이미지화 할 준비를 개발했습니다.
여기서, 우리는 비행이 반 자연주의 행동 (즉, 걷기와 그루밍)을 수행하고 감각 자극에 반응하는 동안 전체 뇌를 이미지하기 위해 특별히 개발 된 방법을 제시하기 위해이 연구를 기반으로합니다. 이는 등쪽 후방 측에서 뇌 전체에 접근할 수 있도록 설계된 관찰 홀더를 사용하여 안테나와 프로보시스를 그대로 두고, 비행을 허용하여 다리를 걸을 수 있도록 허용(예: 공기 쿠션 볼). 헤드의 뒷면을 해부하는 단계는 속도, 재현성을 위해 정제되었으며, 비행의 생존력과 이동성에 미치는 영향을 최소화합니다.
Drosophila는 전체 두뇌가 복잡한 행동 도중 심상될 수 있는 희소한 성인 동물 의 한개입니다. 여기에서, 우리는 비행을 준비하고 진행중인 전체 뇌 활동을 이미지에 전체 뇌를 노출하는 방법을 제시한다. 몇 가지 중요한 점을 주목해야 합니다.
D. 멜라노가스터와 같은 작은 동물을 해부하는 것은 어려운 일입니다. 따라서 방법은 그것을 마스터하기 위해 많은 연습과 인내심이 필요합니다. 그러나, 훈련 후, 절차는 30 분 미만 소요 하 고 재현 가능한 결과 생산.
우리가 제시 한 방법에는 추가 제한이 있습니다. 첫째, 자연적인 위치에서 플라이 헤드를 기울이면 목이 스트레칭되어 결합 조직, 신경 또는 근육에 손상을 줄 수 있습니다. 둘째, 복부 식도 영역(SEZ)은 광학적으로 접근할 수 있지만 반투명 식도 아래에 있어 이 영역의 강도와 해상도가 감소합니다. 마지막으로, 홀더는 대부분의 방향으로 손이 닿지 않지만, 비행은 여전히 때때로 그 존재를 깨닫고 탈출을 시도하도록 밀어 넣습니다.
이러한 제한에도 불구하고, 자극에 대한 반응과 행동 및 반응 중 전체 뇌 이미징에서 얻은 포괄적인 데이터는 동물이 복잡하고 자연주의적 환경과 상호 작용하고 탐색할 때 전체 네트워크의 수준에서 뇌 기능을 해독할 수 있게 합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 하이디 밀러 – Mommerskamp 기술적 인 도움과 원고에 대한 유용한 의견에 대한 이브 멜리사 과티본자 아레발로 감사합니다. 프로토콜의 초기 버전은 랄프 그린스펀의 실험실에서 개발되었다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG)에 의해 지원되었다, 특히 IGK에 FOR2705 (TP3) 보조금을 통해, 사이먼재단 (에이몬 – 414701) 및 뇌와 마음카블리 연구소 (보조금 번호 #2017-954) SA에 의해 수신.
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |