אנו מציגים שיטה המותאמת במיוחד כדי לדמות את המוח כולו של Drosophila הבוגר במהלך ההתנהגות בתגובה לגירויים. הראש ממוקם כדי לאפשר גישה אופטית לכל המוח, בעוד הזבוב יכול להזיז את רגליו ואת האנטנות, את קצה הפרובוסיס, והעיניים יכולות לקבל גירויים חושיים.
אנו מציגים שיטה שפותחה במיוחד כדי לדמות את המוח Drosophila כולו במהלך התנהגות מתמשכת כגון הליכה. קיבוע ראש וניתוח ממוטבים כדי למזער את השפעתם על ההתנהגות. זה מושגת לראשונה באמצעות מחזיק הממזער מכשולי תנועה. החלק האחורי של ראשו של הזבוב מודבק למחזיק זה בזווית המאפשרת גישה אופטית לכל המוח תוך שמירה על יכולתו של הזבוב ללכת, לטפח, להריח, לטעום ולראות. החלק האחורי של הראש מנותח כדי להסיר רקמות בנתיב האופטי ושרירים האחראים על חפצי תנועת הראש. לאחר מכן ניתן לדמיין את המוח הזבוב כדי לתעד את פעילות המוח, למשל באמצעות מחווני סידן או מתח, במהלך התנהגויות ספציפיות כגון הליכה או טיפוח, ובתגובה לגירויים שונים. לאחר הניתוח המאתגר, אשר דורש תרגול ניכר, כבר שולט, טכניקה זו מאפשרת להקליט ערכות נתונים עשירים הקשורים פעילות מוחית שלמה להתנהגות ותגובות גירוי.
הדמיית פעילות המוח בטכניקות שונות העמיקה את ההבנה של תפקוד המוח. בבני אדם, לטכניקות הדמיה מוחית יש מגבלות חשובות: בעוד שהדמיית תהודה מגנטית תפקודית (fMRI) מציעה רזולוציה מרחבית-זמנית הרבה מתחת לרזולוציית נוירון יחיד, טכניקות מהירות כגון אלקטרואנצפלוגרפיה (EEG) מאפשרות גישה עקיפה וחלקית למוח1בלבד . במודלים גדולים מספיק של בעלי חיים כגון מכרסמים, הקלטה של חיישני פעילות פלואורסצנטיים (למשל, GCaMP) באמצעות מיקרוסקופים המותקנים על הראש מאפשרת לבחון את פעילות המוח בזמן שהחיה נעה בסביבתה2. עם זאת, טכניקות אלה כיום לתת גישה רק לחלק קטן של המוח. ניתן לדמיין בעלי חיים קבועים בראש באופן מקיף יותר, אך הכיסוי עדיין חלקי (למשל, משטח קליפת המוח3). רק בבעלי חיים קטנים, כגון זחלי דג הזברה, C. elegans ו Drosophila כי המוח כולו יכול להיות בתמונה עם רזולוציה זמנית ומרחבית ברמה של או קרוב נוירונים בודדים4.
D. melanogaster הוא מבטיח במיוחד כי זה זמן רב שימש אורגניזם מודל גנטי5 וכלים גנטיים רבי עוצמה פותחו6. משלים את הרשת האנטומית בקנה מידה גדול החדש נגזר מיקרוסקופ אלקטרונים7, הזבוב יכול לספק הזדמנויות ייחודיות ללמוד דינמיקה מוחית מורכבת שנוצר ברשת בקנה מידה גדול8. למרות הקוטיקל אינו שקוף, ולכן יש להסיר כדי לדמיין את המוח, הדמיה תפקודית in vivo הפך יותר ויותר נפוץ מאז המחקר הראשון בשנת 20029 וכמה פרוטוקולים כבר פורסמו. עם זאת, שיטות אלה כוללות הפרדת ראש הזבוב מהגוף10, הגבלה חמורה של תנועות הזבוב ו /או תגובות לגירויים11,12,13,14,15, או רק להתיר חלק קטן של המוח להיות בתמונה 9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. כדי להשלים את הגישות החזקות הללו, פיתחנו לאחרונה הכנה לדמות את המוח כולו במהלך ההתנהגות והתגובות לגירויים שונים28.
כאן, אנו בונים על מחקר זה כדי להציג שיטה שפותחה במיוחד כדי לדמות את המוח כולו בעוד הזבוב מבצע התנהגות חצי נטורליסטית (כלומר הליכה וטיפוח) ומגיב לגירויים חושיים. זה מושג על ידי שימוש במחזיק תצפית שנועד לתת גישה למוח כולו מהצד הגבי-אחורי, תוך השארת האנטנות והפרובוסיס ללא פגע, ומתן אפשרות לעוף להזיז את רגליו ללכת (למשל, על כדור מרופד באוויר). צעדים לנתח את החלק האחורי של הראש שוכללו למהירות, לשחזור, ולמזעור השפעתם על הכדאיות והניידות של הזבוב.
דרוזופילה היא אחת החיות הבוגרות הנדירות שבהן ניתן לדמיין את המוח כולו במהלך התנהגויות מורכבות. כאן, אנו מציגים שיטה להכנת הזבוב ולחשוף את כל מוחו כדי לדמות פעילות מוחית מתמשכת. יש לציין מספר נקודות חשובות.
ניתוח חיה קטנה כמו ד. מלנוגאסטר הוא מאתגר. השיטה ולכן דורשת הרבה תרגול וסבלנות לשלוט בה. עם זאת, לאחר האימון, ההליך לוקח פחות מ 30 דקות ומייצר תוצאות לשחזור.
לשיטה שהצגנו יש מגבלות נוספות. ראשית, הטיית ראש הזבוב ממצבו הטבעי מובילה למתוח את הצוואר אשר יכול להזיק רקמת חיבור, עצבים או שריר. שנית, למרות שהאזור התת-קרקעי הגחוני (SEZ) נגיש אופטית, הוא נמצא מתחת לוושט השקוף למחצה, אשר מקטין את העוצמה והרזולוציה באזור זה. לבסוף, למרות המחזיק הוא מחוץ להישג יד ברוב הכיוונים, הזבוב עדיין לפעמים מבין את נוכחותו ודוחף אותו כדי לנסות לברוח.
למרות מגבלות אלה, הנתונים המקיפים המתקבלים מהדמיה מוחית שלמה במהלך ההתנהגות והתגובות לגירויים יאפשרו לפענח את תפקוד המוח ברמת הרשת כולה כאשר החיה מקיימת אינטראקציה עם סביבות מורכבות ונטורליסטיות ומנווטת בהן.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים להיידי מילר-מומרסיקאמפ על העזרה הטכנית ולאיבת מליסה גוטיבונזה רבלו על הערות מועילות על כתב היד. גרסאות ראשוניות של הפרוטוקול פותחו במעבדה של ראלף גרינספן. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG), במיוחד באמצעות מענק עבור 2705 (TP3) ל- IGK, ועל ידי קרן סימונס (Aimon – 414701) ומכון קוולי למוח ולנפש (מספר מענק #2017-954) שהתקבל על ידי SA.
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |