Préparation du drosophile adulte melanogaster pour l’imagerie cérébrale entière pendant les réponses au comportement et aux stimuli

Toutes les étapes sont effectuées sous un stéréomicroscope. 1. Préparation du titulaire Imprimez le support ‘FlyholderVJove.stl’ (voir Matériel supplémentaire)avec une imprimante 3D ou laissez-le imprimer à l’aide de services en ligne (Figure 1A). La fusion SLS (Nylon PA12) et multijet (PA12) convient. Créez la fente de tête. Placez un morceau de ruban adhésif rectangulairement sur une surface plane. Couper une tranche d’environ 5 mm x 1 cm. Couper la fente cervicale (~400 x 400 μm) au milieu du côté plus long du ruban à l’aide de lames parallèles fixes (deux lames de scalpel collées ensemble) pour assurer la même largeur dans chaque support (figure 1B). Placez la bande sur le côté plus plat du trou dans le support sur le côté inférieur (voir la figure 1C et la figure 1D). Le ruban peut être déformé en le poussant vers le bas avec des forceps ~500 μm autour du trou ; cela permettra de minimiser davantage les entraves aux mouvements ultérieurs de la mouche. Couvrez la bande et le support du haut avec du vernis à ongles noir pour empêcher le tampon de s’échapper. Le vernis à ongles noir protégera également les yeux de la mouche de la lumière d’excitation du microscope. Laisser sécher le vernis à ongles au moins une heure avant d’utiliser le support. Une fois que le vernis à ongles est sec, ajouter ~ 1 μL de graisse dans la fente de la tête à l’aide d’un tissu roulé pour s’assurer que la colle ne sera pas mouiller l’arrière de la tête de la mouche (Figure 2A). Assurez-vous de ne pas mettre de graisse à l’extérieur de la fente qui empêcherait la colle de coller. Créez la fente du corps (Figure 2B). En option, préparez la bande qui sera utilisée pour positionner le corps de la mouche (voir ci-dessous) à l’avance. Utilisez la conception indiquée dans la figure 2B (en haut) pour couper un morceau de ruban adhésif d’environ 2 cm de large en deux et couper des tranches de 1,5 mm de large. Découpez des épaules profondes de 0,3 mm et une fente corporelle. Assurez-vous qu’il s’adapte au support.REMARQUE : La variabilité entre les tailles de mouches (en particulier avec le sexe, l’âge, le génotype ou les espèces) peut rendre nécessaire l’ajustement de la conception du ruban adhésif. Si la tête a tendance à être mal centrée, il peut être utile d’ajouter temporairement un morceau de ruban adhésif en forme de V au-dessus de la fente cervicale (figure 3). Appliquez également quelques microlitres de graisse à l’intérieur de la fente du cou et sur le ruban en forme de V. 2. Placer la mouche REMARQUE : Les mouches femelles d’un à quatre jours sont idéales parce que la tête femelle est plus grosse et donc plus facile à disséquer que la tête masculine, et les mouches plus jeunes ont la cuticule plus douce. Pour les expériences de marche, l’activité de la mouche peut être augmentée en faisant correspondre les expériences avec des périodes d’activité circadienne plus élevée (ZT0 ou ZT11), en utilisant de la solution saline contenant du glucose (comme 103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM TES, 8 mM trehalose 2 H2O, 10 mM de glucose, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2·2 H2O, 4 mM MgCl2·6 H2O), en affamant la mouche jusqu’à 24 h avec un environnement d’eau seulement, et en chauffant l’environnement à ~28 °C pendant l’expérience. Couper les ailes au moins un jour à l’avance contribue également à diminuer les tentatives de vol et ainsi augmenter la fréquence des combats demarche 7,29,30. Remplissez un couvercle de boîte à pointes de boîte de Pétri ou de pipette avec de la glace, placez un tissu de laboratoire sur la glace et placez le support à l’envers. Transférez une mouche sur la glace pour la paralyser en la suçant de son flacon dans un tube et en la soufflant sur la glace (assurez-vous que la glace n’est pas fondue, ce qui noierait la mouche). Lorsque la mouche cesse de bouger, utilisez des forceps ternes pour le glisser dans le support avec le cou à l’intérieur de la fente (la mouche peut être tenue à la base de l’aile) comme dans la figure 4 (àgauche). Les yeux doivent être à des positions égales par rapport aux côtés de la fente (figure 4, milieu). Si nécessaire, ajouter 1 μL de graisse sur le dessus de la tête pour empêcher la colle (voir l’étape suivante) d’atteindre l’arrière de la tête et retirer plus tard. Couvrez le corps d’un tissu et d’un peu de glace pour vous assurer que la mouche ne bouge pas pendant cette étape et la suivante (figure 4, à droite). Une autre option pour empêcher les jambes d’atteindre la tête est d’utiliser un morceau de ruban juste en dessous de la tête (voir la figure 6). 3. Sécurisation de la tête Placez la tête à un angle ~20° à partir d’une vue entièrement postérieure (autour de l’axe latéral, voir figure 5A). Il s’agit d’un compromis entre la diminution de la profondeur à l’image et de l’autre côté de maintenir la jambe avant libre de se déplacer et de minimiser l’étirement du cou. Avec un tissu enroulé (figure 5B), mettre de la colle UV autour de la tête tout en évitant de salir la zone sensorielle d’intérêt (antennes, trompes et / ou les yeux). Pour les expériences gustatives, retirez la trompe et ajoutez de la colle à sa base pour empêcher le mouvement. Si aucune expérience gustative n’est prévue, la trompe est mieux poussée dans la tête et fixée avec de la colle pour minimiser le mouvement (Figure 6). Guérir la colle avec de la lumière UV pendant 5 s. Nettoyez soigneusement l’environnement de la tête à l’aide d’un tissu enroulé pour enlever le reste de la colle liquide qui pourrait coller aux jambes et/ou aux zones sensorielles du sol.REMARQUE : Le ruban peut être rugueux avec du papier de verre pour augmenter l’adhérence de la colle si nécessaire. Utilisez une fine bande de ruban adhésif ou un tissu enroulé pour déplacer les jambes vers l’avant (si elles ne sont pas déjà), de sorte qu’ils ne seront pas endommagés par l’étape suivante. 4. Positionnement du corps REMARQUE : Cette étape doit être effectuée rapidement; avant que la mouche ne se remette de l’anesthésie. Retirez le contenant de glace et retournez le support. Retirer l’eau autour de la mouche avec un mouchoir. Placez la bande de fente de corps (créée dans l’étape 1) au-dessus du trou et poussez doucement le corps de la mouche vers le bas (figure 7). Veillez à ne pas trop étirer le cou. 5. Sceller le trou Couvrir les grands trous restants de ruban adhésif. Ajouter ~1 μL de graisse à l’arrière de la tête et dans la région du cou pour s’assurer qu’aucune colle ne s’y mouillera. Avec un tissu enroulé, peindre la colle UV autour et sur le dessus du ruban adhésif et sur le thorax (partie dorsale supérieure du mésonotum) pour le fixer. Guérir la colle avec de la lumière UV pour ~5 s.REMARQUE : Il est important de minimiser l’utilisation de la lumière UV car elle peut fortement affecter la santé de la mouche. Nettoyez soigneusement la graisse et la colle non durcie à l’aide d’un tissu de laboratoire. Mettez ~1 mL de solution saline sur le dessus de la tête. Repoussez les bulles d’air avec des forceps. Recherchez les fuites en plaçant un coverslip sur la solution saline et en retournant le support pour vérifier la solution saline sur le côté avant. S’il y a des fuites, retirez la solution saline et fixez le trou (soit en ajoutant plus de colle ou plus de graisse).REMARQUE : C’est peut-être le bon moment pour faire une pause si nécessaire. La mouche peut être offert un petit morceau de tissu ou de boule de polystyrène à marcher sur pour empêcher les flailing et calmer la mouche vers le bas. 6. Disséquer la tête REMARQUE : Utilisez des forceps aiguisés pour les étapes suivantes. Les forceps très fins sont critiques car les forceps ternes ront le rendre plus difficile d’ouvrir la cuticule de tête et peuvent mener aux dommages additionnels sur la tête ou le cerveau de la mouche. Un grossissement fort peut aider à ce stade. À cet effet, on peut remplacer les oculaires du microscope binoculaire par des oculaires 30x. Faire deux coupes à la base du triangle cuticulaire central foncé de chaque côté du cou (voir croix dans la figure 8A). Couper autour du triangle sombre et enlever cette partie de la cuticule. Le trou dans le cerveau à travers lequel vont le muscle 16 et l’œsophage doit maintenant être visible et se déplacer rythmiquement(la vidéo 1 présente ce mouvement rythmique dans une mouche avec des muscles fluorescents). Pincez soigneusement le dessus de cette zone pour couper le muscle 16 sans percer l’œsophage. Si le mouvement rythmique du cerveau s’est arrêté, le muscle 16 a probablement été enlevé, cependant, le mouvement s’arrête parfois et redémarre plus tard. Il est donc important de prêter attention aux mouvements rythmiques et d’effectuer cette étape à nouveau si nécessaire. Couper le reste de la cuticule en petits morceaux et les enlever soigneusement. Essayez de ne pas trop tirer sur la cuticule. Utilisez plutôt les forceps comme une paire de ciseaux, pour couper des morceaux de tissu. On peut commencer sur les bords médiaux, où le triangle sombre a été enlevé avant et travailler son chemin vers les côtés.REMARQUE : Des morceaux de cuticule peuvent être utilisés pour gratter doucement les gros corps s’ils sont présents. Retirez les sacs d’air une pièce après l’autre en les saisissant avec les forceps et en tirant lentement et régulièrement.