We presenteren een methode die specifiek is afgestemd op het beeld van de hele hersenen van volwassen Drosophila tijdens gedrag en als reactie op stimuli. Het hoofd is gepositioneerd om optische toegang tot de hele hersenen mogelijk te maken, terwijl de vlieg zijn benen en de antennes kan bewegen, de punt van de proboscis en de ogen zintuiglijke stimuli kunnen ontvangen.
We presenteren een methode die speciaal is ontwikkeld om het hele Drosophila-brein in beeld te brengen tijdens voortdurend gedrag zoals lopen. Hoofdfixatie en dissectie zijn geoptimaliseerd om hun impact op gedrag te minimaliseren. Dit wordt eerst bereikt door een houder te gebruiken die bewegingshinder minimaliseert. De achterkant van het hoofd van de vlieg is aan deze houder gelijmd onder een hoek die optische toegang tot de hele hersenen mogelijk maakt met behoud van het vermogen van de vlieg om te lopen, verzorgen, ruiken, proeven en zien. De achterkant van het hoofd wordt ontleed om weefsels in het optische pad en spieren te verwijderen die verantwoordelijk zijn voor artefacten voor hoofdbeweging. De vlieghersenen kunnen vervolgens worden afgebeeld om hersenactiviteit vast te leggen, bijvoorbeeld met behulp van calcium- of spanningsindicatoren, tijdens specifiek gedrag zoals lopen of verzorgen, en als reactie op verschillende stimuli. Zodra de uitdagende dissectie, die veel oefening vereist, onder de knie is, maakt deze techniek het mogelijk om rijke datasets vast te leggen die hele hersenactiviteit relateeren aan gedrag en stimulusreacties.
Beeldvorming hersenactiviteit met behulp van verschillende technieken hebben het begrip van de hersenfunctie verdiept. Bij mensen hebben hersenbeeldvormingstechnieken belangrijke beperkingen: terwijl functionele magnetische resonantiebeeldvorming (fMRI) een spatio-temporele resolutie biedt die ver onder de resolutie van één neuron ligt, bieden snelle technieken zoals elektro-encefalografie (EEG) alleen indirecte en gedeeltelijke toegang tot de hersenen1. In voldoende grote diermodellen zoals knaagdieren maakt het registreren van fluorescerende activiteitssensoren (bijv. GCaMP) met behulp van op het hoofd gemonteerde microscopen het mogelijk om hersenactiviteit te observeren terwijl het dier in zijn omgeving beweegt2. Toch geven deze technieken momenteel slechts toegang tot een klein deel van de hersenen. Hoofdvaste dieren kunnen uitgebreider worden afgebeeld, maar de dekking is nog steeds gedeeltelijk (bijv. het cortexoppervlak3). Het is alleen bij kleine dieren, zoals de zebravislarven, C. elegans jp Drosophila dat de hele hersenen kunnen worden afgebeeld met temporele en ruimtelijke resolutie op het niveau van of dicht bij enkele neuronen4.
D. melanogaster is bijzonder veelbelovend omdat het al lang wordt gebruikt als een genetisch modelorganisme5 en krachtige genetische hulpmiddelen zijn ontwikkeld6. Aangevuld met het nieuwe grootschalige anatomische netwerk afgeleid van elektronenmicroscopie7, zou de vlieg unieke mogelijkheden kunnen bieden om complexe hersendynamiek te bestuderen die op een grootschalig netwerk wordt gegenereerd8. Hoewel de cuticula niet transparant is en dus moet worden verwijderd om de hersenen in beeld te brengen, is in vivo functionele beeldvorming sinds de eerste studie in 2002steeds gebruikelijker geworden 9 en zijn er al verschillende protocollen gepubliceerd. Deze methoden omvatten echter ofwel het scheiden van de vliegkop van het lichaam10, het ernstig beperken van de bewegingen van de vlieg en / of reacties op stimuli11,12,13,14,15, of het toestaan van slechts een klein deel van de hersenen om te worden afgebeeld9,16,25 , 26,27,17 ,18,19,20,21,22,2. Om deze toch krachtige benaderingen aan te vullen, hebben we onlangs een voorbereiding ontwikkeld om het hele brein in beeld te krijgen tijdens gedrag en reacties op verschillende stimuli28.
Hier bouwen we voort op deze studie om een methode te presenteren die speciaal is ontwikkeld om het hele brein in beeld te brengen, terwijl de vlieg semi-naturalistisch gedrag vertoont (d.w.z. lopen en verzorgen) en reageert op zintuiglijke stimuli. Dit wordt bereikt door een observatiehouder te gebruiken die is ontworpen om toegang te geven tot de hele hersenen vanaf de dorsaal-posterieure kant, terwijl de antennes en slurf intact blijven en de vlieg zijn benen laat bewegen om te lopen (bijvoorbeeld op een bal met luchtkussen). Stappen voor het ontleden van de achterkant van het hoofd zijn verfijnd voor snelheid, reproduceerbaarheid en om hun effect op de levensvatbaarheid en mobiliteit van de vlieg te minimaliseren.
Drosophila is een van de zeldzame volwassen dieren waar de hele hersenen kunnen worden afgebeeld tijdens complex gedrag. Hier presenteren we een methode om de vlieg voor te bereiden en zijn hele hersenen bloot te stellen aan beeld voortdurende hele hersenactiviteit. Er moeten een aantal belangrijke punten worden opgemerkt.
Het ontleden van een klein dier zoals D. melanogaster is een uitdaging. De methode vereist dus veel oefening en geduld om het onder de knie te krijgen. Na de training duurt de procedure echter minder dan 30 minuten en levert reproduceerbare resultaten op.
De methode die we presenteerden heeft extra beperkingen. Ten eerste leidt het kantelen van de vliegkop vanuit zijn natuurlijke positie tot het uitrekken van de nek, wat schadelijk kan zijn voor bindweefsel, zenuwen of spieren. Ten tweede, hoewel de ventrale subesophageale zone (SEZ) optisch toegankelijk is, bevindt deze zich onder de semi-transparante slokdarm, wat de intensiteit en resolutie in dit gebied vermindert. Ten slotte, hoewel de houder in de meeste richtingen buiten bereik is, realiseert de vlieg zich nog steeds soms zijn aanwezigheid en duwt erop om te proberen te ontsnappen.
Ondanks deze beperkingen zullen de uitgebreide gegevens verkregen uit hele hersenbeeldvorming tijdens gedrag en reacties op stimuli het mogelijk maken om de hersenfunctie op het niveau van het hele netwerk te ontcijferen wanneer het dier interageert met en navigeert door complexe, naturalistische omgevingen.
The authors have nothing to disclose.
We danken Heidi Miller-Mommerskamp voor technische hulp en Iveth Melissa Guatibonza Arevalo voor nuttige opmerkingen over het manuscript. De eerste versies van het protocol werden ontwikkeld in het laboratorium van Ralph Greenspan. Dit werk werd ondersteund door de Duitse onderzoeksstichting (DFG), met name door een subsidie FOR2705 (TP3) aan IGK, en door de Simons foundation (Aimon – 414701) en het Kavli Institute for Brain and Mind (subsidienummer #2017-954) ontvangen door SA.
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |