JoVE Journal > Biochemistry
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生化学

Proteinlerin Daha Yüksek Sıralı Yapısal Analizini Gerçekleştirmek için Lazersiz Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi

Published: June 04, 2021
doi:
10.3791/61861
, , ,
1GenNext Technologies Inc., 2Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy,University of Mississippi, 3Department of Chemistry and Biochemistry,University of Mississippi

概要

Bu protokol, sıralı radikal dozimetri ve flaş oksidasyon proteini ayak izi gerçekleştirmek için bir plazma ışık kaynağı kullanmak için bir yöntem sunar. Bu yöntem, protein çalışmalarının hızlı fotokimyasal oksidasyonunun tekrarlanabilirliğini basitleştirmek ve iyileştirmek için tehlikeli UV lazerin yerini alır.

Abstract

Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi (HRPF), protein yapısındaki değişiklikler, protein-protein etkileşimleri veya protein-ligand etkileşimleri hakkında bilgi sağlayan gelişmekte olan ve umut verici bir yüksek sıralı yapısal analiz tekniğidir. HRPF, bir proteinin çözücü erişilebilir yüzeyini geri döndürülemez bir şekilde etiketlemek için hidroksil radikalleri(▪OH) kullanır. HRPF gerçekleştirmenin doğasında var olan karmaşıklık, maliyet ve tehlikeli doğa, biyofarmada geniş tabanlı benimsemeyi önemli ölçüde sınırladır. Bu faktörler şunlardır: 1) önemli güvenlik önlemleri gerektiren karmaşık, tehlikeli ve pahalı lazerlerin kullanımı; ve 2) HRPF’nin, karşılaştırmalı çalışmaları sınırlayan ▪OH’nun arka plan çöplüğünden kaynaklanan irreproducibility. Bu yayın, lazersiz bir HRPF sisteminin çalışması için bir protokol sağlar. Bu lazersiz HRPF sistemi, sıralı radikal dozimetriye sahip yüksek enerjili, yüksek basınçlı plazma ışık kaynağı flaş oksidasyon teknolojisini kullanır. Plazma ışık kaynağı lazer tabanlı HRPF sistemlerine göre hidroksil radikalleri üretmede daha güvenli, kullanımı daha kolay ve daha verimlidir ve hat içi radikal dozimetre çalışmaların tekrarlanabilirliğini artırır. Lazersiz HRPF sistemi, lazer tabanlı tekniklerin belirtilen eksikliklerini ve sınırlamalarını bir araya getirdiğini ve adını ortaya çıkarmaktadır.

Introduction

Protein uyumu ve ilişkili yüksek düzen yapısı (HOS) uygun biyolojik fonksiyonun ve sapkın davranışın temel belirleyicileridir1. Aynı şey, yapısı ve fonksiyonel aktivitesi üretim ve çevrelerinin çeşitli yönlerine bağlı olan biyofarmasötikler için de geçerlidir. HOS’taki biyofarmasötik değişim, istenmeyen farmakoloji ve hasta immünolojik yanıtına atfedilen advers ilaç reaksiyonları (ADR) ile bağlantılıdır2,3. ADR’lerin ortaya çıkışı, biyofarmasötik endüstrisini protein HOS’un biyoterapötiklerin güvenliğinde ve verimliliğinde oynadığı kritik role karşı uyarmıştır ve yeni ve geliştirilmiş HOS analitiği ihtiyacını ortaya atmıştır4.

Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi (HRPF), protein HOS’taki değişimi izlemek için umut verici bir tekniktir. HRPF, proteinin5,6,7çözücü erişilebilir yüzeyini tanımlamak için kütle spektrometresi (MS) analizi ile takip edilen ▪OH ile bir proteinin dış yüzeyinin geri dönüşü olmayan etiketlemesini içerir. HRPF, protein HOS ve işlevi8 ,9,monoklonal antikorların HOS’u (mAb)10,11, 12,13,bir ligand14’ünbağlayıcı Kd’sini belirlemek ve çok daha fazlası15, 16,17,18,19‘u karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. HRPF için ▪OH’yi oluşturmak için yaygın bir yöntem, H 2 O2fotolizisinden ▪OH üretmek için yüksek enerjili, hızlı UV lazerler kullanan Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonudur (FPOP). Çoğunlukla, FPOP solunum ve göz yaralanmalarını önlemek için önemli önlemler gerektiren tehlikeli gaz (KrF) kullanan pahalı excimer lazerler kullanır20. Soluma tehlikelerini önlemek için, diğerleri frekans dörtlü neodimyum alümünyum garnet (Nd:YAG) lazerlerikullandılar 21Toksik gaz kullanımını ortadan kaldırır, ancak hala maliyetlidir, önemli operasyonel uzmanlık gerektirir ve kullanıcıları göz yaralanmasından korumak için kapsamlı başıboş ışık kontrolleri talep eder.

HRPF kullanılarak geniş bilgi elde edilebilse de, biyofarmada geniş benimseme karşılanmadı. Sınırlı HRPF benimsemesi için iki engel şunlardır: 1) önemli güvenlik önlemleri gerektiren tehlikeli ve pahalı lazerlerin kullanımı20; ve 2) HRPF’nin, karşılaştırmalı çalışmaları sınırlayan ▪OH’nun arka plan çöplüğünden kaynaklanan irreproducibility22. Lazer kullanımını desteklemek için, FPOP’u facile bir şekilde güvenli bir şekilde gerçekleştirmek için yüksek hızlı, yüksek enerjili plazma flaş fotoliz ünitesi geliştirilmiştir. HRPF deneylerinin geri alınamazlığını geliştirmek için gerçek zamanlı radikal dozimetri uygulanır.

HRPF uygulaması, ▪OH22’ninarka plan çöplüğüne atfedilen geri alınamazlık ile sınırlanmıştır. ▪OH mükemmel protein topografyası probları olsa da, preparatlarda bulunan birçok bileşenle de reaksiyona girerek, hedef proteini oksitlemek için mevcut olan radikalin etkili konsantrasyonunun ölçülmesi gerekir. Tampon hazırlama, hidrojen peroksit konsantrasyonu, ligand özellikleri veya fotolizdeki varyasyonlar, HOS diferansiyel çalışmalarında belirsizlik yaratan kontrol ve deneysel gruplar arasında oksidasyon farklılıklarına neden olabilir. Gerçek zamanlı radikal dozimetrinin eklenmesi, OH yükü ▪etkinin ayarını sağlar ve bu nedenle bir HRPF deneyi sırasında güveni ve tekrarlanabilirliği arttırır. FPOP’ta radikal dozimetri kullanımı başka bir yerde açıklanmıştır23,24,25, ve yakın tarihli bir yayında daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır26. Burada, bir FPOP deneyindeki peptit oksidasyon seviyelerini bir ekscimer lazer kullanırken elde edilenlerle karşılaştırarak at apo-myoglobin ‘i (aMb) etiketlemek için yeni bir flaş fotoliz sistemi ve gerçek zamanlı dozimetri kullanımını açıklıyoruz.

Protocol

1. Kılcal borunun takılması Bir silika dekolte taşı kullanarak, 250 μm iç çap (ID) silika kılcal damarı 27 inç’e bölün. Kılcal uçları temiz ve düz bir kesim için kontrol edin. Poliimid kaplamayı yakarak kabaca 15 mm uzunluğunda iki pencere oluşturun. “Alt uçtan” başlayarak, ilk fotoliz penceresini “alt uçtan” 90 mm ve ikinci dozimetre penceresini “alt uçtan” 225 mm uzağa yapın.NOT: Kaplama yandıktan sonra kılcal damar çok kırılgandır. 5 numaralı bağlant…

Representative Results

Gerçek zamanlı dozimetri ile birleştirilen yüksek basınçlı plazma kaynağı, daha yüksek dereceli protein yapısındaki değişiklikleri daha doğru bir şekilde gözlemlemek için ▪OH veriminin daha iyi kontrol etmesini sağlar. Adenin eklenmesi etkili bir gerçek zamanlı radikal dozimetre sağlar. Oksidasyon üzerine, adenin UV emiciliğini 265 nm’de kaybeder(Şekil 2A). Adenin emiciliğindeki değişiklik, HRPF için mevcut olan radikallerin konsantrasyonu ile doğru…

Discussion

Herhangi bir HRPF deneyi sırasında proteinlerin doğru etiketlenebilmesini sağlamak için birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, numunenin her bolusunun bir kez ışınlandığını emin olmak için uygun bir akış hızı ve kaynak flaş hızı seçilir. Bu, proteinin yeni oluşan ▪OH’nin tek bir bolus’una maruz kalmasını sağlar. Bir protein oksitlendikten sonra, daha yüksek sıralı protein yapısı değiştirilebilir. Yerli protein yapısının araştırıldığından emin olmak için, her prot…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (R43GM125420 ve R44GM125420) tarafından finanse edildi.

Materials

15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes Fisher Scientific SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
Apomyoglobin Sigma-Aldrich
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide Chem-Impex 03109
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
  2. Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
  3. Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
  4. Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
  5. Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
  6. Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. 生化学. 44 (9), 3166-3175 (2005).
  7. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
  8. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  9. Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
  10. Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
  11. Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
  12. Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  13. Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
  14. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  15. Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
  16. Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
  17. Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  18. Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
  19. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
  20. Linde. . Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
  21. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
  22. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  23. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
  24. Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
  25. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  26. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
  27. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  28. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
  29. Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
  30. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
  31. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  32. Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
  33. Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
  34. Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
  35. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  36. Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
  37. Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).

タグ

Protein FootprintingHydroxyl RadicalLaser-freeProtein StructureProtein InteractionProtein AggregationProtein StabilityCapillaryPhotolysisDosimetrySilicaPolyimideNutFerrulePhotolysis CellDosimeter CellMagnetic MaskTeflon TubingInjection Loop

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins. J. Vis. Exp. (172), e61861, doi:10.3791/61861 (2021).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image