JoVE Journal > Biochemistry
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生化学

Laservrije hydroxyl radicale eiwitvoetafdruk om structurele analyse van eiwitten in hogere orde uit te voeren

Published: June 04, 2021
doi:
10.3791/61861
, , ,
1GenNext Technologies Inc., 2Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy,University of Mississippi, 3Department of Chemistry and Biochemistry,University of Mississippi

概要

Dit protocol presenteert een methode om inline radicale dosimetrie en een plasma lichtbron te gebruiken om flash oxidatie eiwit footprinting uit te voeren. Deze methode vervangt de gevaarlijke UV-laser om de reproduceerbaarheid van snelle fotochemische oxidatie van eiwitstudies te vereenvoudigen en te verbeteren.

Abstract

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is een opkomende en veelbelovende hogere orde structurele analysetechniek die informatie biedt over veranderingen in eiwitstructuur, eiwit-eiwit interacties of eiwit-ligand interacties. HRPF maakt gebruik van hydroxylradicalen(▪OH) om het oplosmiddeltoegankelijke oppervlak van een eiwit onomkeerbaar te labelen. De inherente complexiteit, kosten en gevaarlijke aard van het uitvoeren van HRPF hebben een aanzienlijk beperkte brede acceptatie in biopharma. Deze factoren omvatten: 1) het gebruik van gecompliceerde, gevaarlijke en dure lasers die aanzienlijke veiligheidsmaatregelen vereisen; en 2) de onherproduceerbaarheid van HRPF veroorzaakt door achtergrondopruiming van ▪OH die vergelijkende studies beperken. Deze publicatie biedt een protocol voor de werking van een laservrij HRPF-systeem. Dit laservrije HRPF-systeem maakt gebruik van een hoge energie, hoge druk plasma lichtbron flash oxidatie technologie met in-line radicale dosimetrie. De plasmalichtbron is veiliger, gemakkelijker te gebruiken en efficiënter in het genereren van hydroxylradicalen dan lasergebaseerde HRPF-systemen, en de in-line radicale dosimeter verhoogt de reproduceerbaarheid van studies. Gecombineerd pakt het laservrije HRPF-systeem de genoemde tekortkomingen en beperkingen van lasergebaseerde technieken aan en overtreft het deze.

Introduction

Eiwitconformatie en bijbehorende hogere ordestructuur (HOS) zijn de belangrijkste determinanten van een goede biologische functie en afwijkend gedrag1. Hetzelfde geldt voor biofarmaceutica, waarvan de structuur en functionele activiteit afhankelijk zijn van verschillende aspecten van hun productie en omgeving. Biofarmaceutische veranderingen in HOS zijn gekoppeld aan bijwerkingen (ADR) toegeschreven aan ongewenste farmacologie en immunologische respons van de patiënt2,3. Het verschijnen van ADR’s heeft de biofarmaceutische industrie gewaarschuwd voor de cruciale rol die eiwit-HOS speelt in de veiligheid en werkzaamheid van biotherapeutica, en ze hebben de behoefte aan nieuwe en verbeterde HOS-analyses vastgesteld4.

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is een veelbelovende techniek om de verandering in eiwit HOS te volgen. HRPF omvat de onomkeerbare etikettering van de buitenkant van een eiwit met ▪OH gevolgd door massaspectrometrie (MS) analyse om het oplosmiddel toegankelijke oppervlak van het eiwit5,6,7te identificeren . HRPF is met succes gebruikt om defecten in eiwit HOS en zijn functie te detecteren8,9, karakteriseren de HOS van monoklonale antilichamen (mAb)10,11,12,13, bepalen de binding Kd van een ligand14, en nog veel meer15,16,17,18,19. Een veel voorkomende methode om de ▪OH voor HRPF te genereren is Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP), die gebruik maakt van energierijke, snelle UV-lasers om ▪OH te produceren uit fotolyse van H2O2. FPOP maakt voor het grootste deel gebruik van dure excimerlasers die gevaarlijk gas (KrF) gebruiken en die aanzienlijke waarborgen vereisen om ademhalings- en oogletsel te voorkomen20. Om inhalatiegevaren te voorkomen, hebben anderen frequentie verviervoudigde neodymium yttrium aluminium granaat (Nd:YAG) lasers21gebruikt, die het gebruik van giftig gas elimineert, maar nog steeds duur is, aanzienlijke operationele expertise vereist en uitgebreide verdwaalde lichtcontroles vereist om gebruikers te beschermen tegen oogletsel.

Hoewel er voldoende informatie kan worden verkregen met behulp van HRPF, is niet voldaan aan een brede acceptatie in biofarma. Twee barrières voor de beperkte HRPF-goedkeuring zijn: 1) het gebruik van gevaarlijke en dure lasers die aanzienlijke veiligheidsmaatregelen vereisen20; en 2) de onherproduceerbaarheid van HRPF veroorzaakt door achtergrondopruiming van ▪OH die vergelijkende studies beperken22. Om lasergebruik te verdringen, werd een high-speed, high energy plasmaflitser fotolyse-eenheid ontwikkeld om FPOP veilig op een facile manier uit te voeren. Om de onherproductieve hrpf-experimenten te verbeteren, wordt real-time radicale dosimetrie geïmplementeerd.

De praktijk van HRPF is beperkt door onherkenbaarheid toegeschreven aan achtergrondopruiming van ▪OH22. Hoewel ▪OH uitstekende sondes van eiwittopografie zijn, reageren ze ook met veel bestanddelen die in preparaten worden aangetroffen, waardoor het noodzakelijk is om de effectieve concentratie van radicalen te meten die beschikbaar is om een doeleiwit te oxideren. Variaties in buffervoorbereiding, waterstofperoxideconcentratie, ligandeigenschappen of fotolyse kunnen leiden tot oxidatieverschillen tussen controle- en experimentele groepen die ambiguïteit creëren in HOS-differentiaalstudies. De toevoeging van real-time radicale dosimetrie maakt het mogelijk om het effect ▪ OH-belasting aan tepassen en verhoogt daardoor het vertrouwen en de reproduceerbaarheid tijdens een HRPF-experiment. Het gebruik van radicale dosimetrie in FPOP is elders beschreven23,24,25, en wordt verder in detail besproken in een recente publicatie26. Hier beschrijven we het gebruik van een nieuw flitsfotolysesysteem en real-time dosimetrie om equine apo-myoglobine (aMb) te labelen, waarbij we de niveaus van peptideoxidatie in een FPOP-experiment vergelijken met die van verkregen bij het gebruik van een excimerlaser.

Protocol

1. Installatie van de capillaire buis Met behulp van een silica kloven steen, splitsen 250 μm binnendiameter (ID) silica capillair tot 27 inch. Controleer de capillaire uiteinden op een schone, rechte snede. Maak twee ramen van ongeveer 15 mm lang door de polyimide coating weg te branden. Vanaf het “onderste uiteinde” maakt u het eerste fotolysevenster op 90 mm afstand van het “onderste uiteinde” en het tweede dosimetervenster op 225 mm afstand van het “onderste uiteinde”.OPMERKING: Zodra de coat…

Representative Results

De hogedrukplasmabron in combinatie met real-time dosimetrie maakt een betere controle van ▪OH-opbrengst mogelijk om veranderingen in de eiwitstructuur van hogere orde nauwkeuriger te observeren. De toevoeging van adenine zorgt voor een effectieve real-time radicale dosimeter. Bij oxidatie verliest adenine uv-absorptie bij 265 nm (figuur 2A). De verandering in adenineabsorpties houdt rechtstreeks verband met de concentratie radicalen die beschikbaar is voor HRPF en biedt zo een …

Discussion

Er zijn verschillende kritieke stappen om een goede etikettering van eiwitten tijdens elk HRPF-experiment te garanderen. Ten eerste worden een geschikt debiet en de bronflitssnelheid geselecteerd om ervoor te zorgen dat elke bolus van het monster eenmaal wordt bestraald. Dit zorgt ervoor dat het eiwit wordt blootgesteld aan een enkele bolus van nieuw gevormde ▪OH. Zodra een eiwit is geoxideerd, kan de eiwitstructuur van een hogere orde worden gewijzigd. Om er zeker van te zijn dat de inheemse eiwitstructuur …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 en R44GM125420).

Materials

15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes Fisher Scientific SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
Apomyoglobin Sigma-Aldrich
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide Chem-Impex 03109
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
  2. Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
  3. Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
  4. Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
  5. Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
  6. Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. 生化学. 44 (9), 3166-3175 (2005).
  7. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
  8. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  9. Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
  10. Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
  11. Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
  12. Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  13. Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
  14. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  15. Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
  16. Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
  17. Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  18. Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
  19. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
  20. Linde. . Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
  21. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
  22. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  23. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
  24. Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
  25. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  26. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
  27. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  28. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
  29. Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
  30. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
  31. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  32. Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
  33. Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
  34. Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
  35. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  36. Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
  37. Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).

タグ

Protein FootprintingHydroxyl RadicalLaser-freeProtein StructureProtein InteractionProtein AggregationProtein StabilityCapillaryPhotolysisDosimetrySilicaPolyimideNutFerrulePhotolysis CellDosimeter CellMagnetic MaskTeflon TubingInjection Loop

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins. J. Vis. Exp. (172), e61861, doi:10.3791/61861 (2021).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image