Uvéite auto-immune expérimentale : un modèle murin inflammatoire intraoculaire
概要
Dans ce rapport, nous présentons un protocole qui permet à l’investigateur de générer un modèle murin d’uvéite intraoculaire. Plus communément appelé uvéite auto-immune expérimentale (EAU), ce modèle établi englobe de nombreux aspects de la maladie humaine. Ici, nous décrirons comment induire et surveiller la progression de la maladie à l’aide de plusieurs lectures.
Abstract
L’uvéite auto-immune expérimentale (EAU) est provoquée par des cellules immunitaires répondant à des auto-antigènes. De nombreuses caractéristiques de ce modèle de maladie inflammatoire intraoculaire non infectieuse récapitulent le phénotype clinique de l’uvéite postérieure chez l’homme. L’EAU a été utilisée de manière fiable pour étudier l’efficacité de nouveaux traitements inflammatoires, leur mode d’action et pour étudier plus avant les mécanismes qui sous-tendent la progression de la maladie des troubles intraoculaires. Ici, nous fournissons un protocole détaillé sur l’induction d’EAU chez la souris C57BL / 6J – l’organisme modèle le plus largement utilisé avec une sensibilité à cette maladie. L’évaluation clinique de la gravité et de la progression de la maladie sera démontrée à l’aide de la fundoscopie, de l’examen histologique et de l’angiographie à la fluorescéine. La procédure d’induction implique l’injection sous-cutanée d’une émulsion contenant un peptide (IRBP1-20) de la protéine de liaison au rétinoïde interphotorécepteur oculaire (également connue sous le nom de protéine de liaison au rétinol 3), adjuvant de Freund complet (CFA) et complétée par Mycobacterium tuberculosis. L’injection de cette émulsion visqueuse sur la nuque est suivie d’une seule injection intrapéritonéale de toxine Bordetella pertussis . Au début des symptômes (jours 12-14) et sous anesthésie générale, des images fundoscopiques sont prises pour évaluer la progression de la maladie par l’examen clinique. Ces données peuvent être directement comparées à celles des points temporels ultérieurs et du pic de la maladie (jours 20-22) avec des différences analysées. En même temps, ce protocole permet à l’investigateur d’évaluer les différences potentielles de perméabilité et de dommages des vaisseaux à l’aide de l’angiographie à la fluorescéine. L’EAU peut être induite dans d’autres souches de souris – à la fois de type sauvage ou génétiquement modifié – et combinée à de nouvelles thérapies offrant une flexibilité pour étudier l’efficacité des médicaments et / ou les mécanismes de la maladie.
Introduction
Ce protocole démontrera comment induire l’uvéite auto-immune expérimentale (EAU) chez la souris C57BL/6J par une injection sous-cutanée unique d’un antigène rétinien dans un adjuvant émulsionné. Les méthodes de surveillance et d’évaluation de la progression de la maladie seront détaillées au moyen de l’imagerie fundoscopique et de l’examen histologique, avec des paramètres de mesure décrits à l’intérieur. En outre, l’angiographie à la fluorescéine, une technique d’examen de la structure et de la perméabilité des vaisseaux sanguins de la rétine, sera discutée.
Ce modèle EAU récapitule les caractéristiques centrales de l’uvéite postérieure non infectieuse chez l’homme en ce qui concerne les caractéristiques clinicopathologiques et les mécanismes cellulaires et moléculaires de base qui conduisent la maladie. L’EAU est médiée par des sous-ensembles Th1 et/ou Th17 de lymphocytes CD4+T autoréactifs, comme le montrent les expériences de transfert adoptif et chez des souris appauvries en IFNγ1. Une grande partie de notre compréhension des rôles potentiels de ces cellules dans l’uvéite provient de l’étude de l’EAU2 où les cellules Th1 et Th17 sont détectées dans les tissus rétiniens3. Souvent, l’EAU est utilisée comme modèle préclinique pour évaluer l’utilité de nouvelles thérapies dans l’atténuation de la maladie. Les approches thérapeutiques qui ont réussi à moduler la maladie EAU ont montré une certaine efficacité en clinique et ont atteint le statut approuvé par la FDA. Des exemples de ceux-ci sont des groupes de médicaments immunorégulateurs tels que les thérapies ciblant les lymphocytes T: cyclosporine, FK-506 et rapamycine 4,5,6. Récemment, des interventions ciblant de nouvelles voies ont également été explorées dans ce modèle pour étudier à la fois le mécanisme et l’effet sur l’issue de la maladie. Il s’agit notamment de cibler la régulation transcriptionnelle par le lecteur de chromatine Bromodomain Extra-Terminal (BET) protéines et inhibiteurs de P-TEFb3. De plus, des approches plus conventionnelles telles qu’un inhibiteur de VLA-4 ont récemment démontré la suppression dans l’EAU via la modulation des lymphocytes T CD4+ effecteurs7. En outre, le ciblage des cellules Th17 avec TMP778, un agoniste inverse RORγt, s’est également avéré supprimer de manière significative l’EAU8. De plus, ce modèle offre la possibilité d’étudier l’inflammation auto-immune chronique dans la rétine et les mécanismes sous-jacents qui l’accompagnent tels que l’amorçage des lymphocytes.
Les résultats primaires des études précliniques sur l’eau sont l’évaluation clinique par imagerie par fundoscopie rétinienne et, moins fréquemment, par l’évaluation de l’intégrité rétinienne par tomographie par cohérence optique (OCT). L’évaluation histopathologique rétinienne et l’immunophénotypage des cellules rétiniennes par cytométrie de flux sont ensuite entrepris à la fin. Fundoscopy est un système d’imagerie en direct facile à utiliser qui permet une évaluation clinique rapide et reproductible de l’ensemble de la rétine. Pour les évaluations immunohistochimiques, les techniques sont basées sur la préparation de coupes rétiniennes qui nous permettent d’étudier l’architecture tissulaire pour le degré d’inflammation et de dommages structurels9. Les critères d’évaluation et les systèmes de notation conventionnels, pour toutes les techniques utilisées, seront décrits dans ce protocole. L’étendue des dommages enregistrés à l’aide de l’imagerie fundoscopique est souvent étroitement corrélée aux changements histologiques. Cette double approche de surveillance et d’évaluation de la gravité de la maladie offre une plus grande sensibilité et des résultats de mesure plus fiables.
L’EAU est un modèle bien établi et couramment utilisé pour les essais précliniques et l’investigation des maladies oculaires à médiation immunitaire. Ce modèle est fiable et reproductible avec >95% d’incidence de la maladie et génère des données complètes qui peuvent être utilisées pour valider ou répudier de nouvelles thérapies pour le traitement de la maladie inflammatoire intraoculaire qui représente une cause majeure de cécité en âge de travailler dans le monde10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les modèles animaux expérimentaux sont des outils nécessaires pour étudier la pathogenèse des maladies et les essais précliniques de nouveaux paradigmes thérapeutiques. Dans le protocole actuel, nous avons discuté d’une méthodologie pour induire, surveiller et noter EAU, un modèle expérimental d’uvéite inflammatoire intraoculaire. Ce modèle d’EAU a une incidence de plus de 95% de la maladie lorsque toutes les procédures sont effectuées conformément au protocole décrit dans le présent document, et …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JG a reçu une bourse d’études UCL Impact et un financement Rosetrees Trust pour soutenir CB. VC a reçu une subvention de collaboration de recherche d’Akari Therapeutics Inc. Nous tenons à remercier l’Institut d’ophtalmologie de l’UCL, l’unité de service biologique, en particulier Mme Alison O’Hara et son équipe pour leur soutien technique.
Materials
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
参考文献
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