التهاب القزحية المناعي الذاتي التجريبي: نموذج فأر التهابي داخل العين
概要
في هذا التقرير نقدم بروتوكولا يسمح للمحقق بإنشاء نموذج فأر لالتهاب القزحية داخل العين. يشار إليه بشكل أكثر شيوعا باسم التهاب العنبية المناعي الذاتي التجريبي (EAU) ، يلتقط هذا النموذج الثابت العديد من جوانب الأمراض البشرية. هنا ، سنصف كيفية تحفيز ومراقبة تطور المرض باستخدام العديد من القراءات.
Abstract
التهاب العنبية المناعي الذاتي التجريبي (EAU) مدفوع بالخلايا المناعية التي تستجيب للمستضدات الذاتية. تلخص العديد من ميزات هذا النموذج غير المعدي للمرض الالتهابي داخل العين النمط الظاهري السريري لالتهاب العنبية الخلفي الذي يصيب البشر. تم استخدام EAU بشكل موثوق لدراسة فعالية العلاجات الالتهابية الجديدة وطريقة عملها ولمزيد من التحقيق في الآليات التي تدعم تطور المرض لاضطرابات العين. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا حول تحريض EAU في الماوس C57BL / 6J – الكائن النموذجي الأكثر استخداما مع قابلية لهذا المرض. سيتم إثبات التقييم السريري لشدة المرض وتطوره باستخدام تنظير قاع القاع والفحص النسيجي وتصوير الأوعية بالفلوريسين. يتضمن إجراء الحث الحقن تحت الجلد لمستحلب يحتوي على ببتيد (IRBP1-20) من بروتين ربط الريتينويد بين مستقبلات العين (المعروف أيضا باسم بروتين ربط الريتينول 3) ، مساعد فرويند الكامل (CFA) ومكمل مع المتفطرة السلية المقتولة. يتبع حقن هذا المستحلب اللزج على الجزء الخلفي من الرقبة حقنة واحدة داخل الصفاق من توكسين السعال الديكي Bordetella . في بداية الأعراض (اليوم 12-14) وتحت التخدير العام ، يتم التقاط صور تنظير القاع لتقييم تطور المرض من خلال الفحص السريري. يمكن مقارنة هذه البيانات مباشرة مع تلك الموجودة في نقاط زمنية لاحقة وذروة المرض (اليوم 20-22) مع تحليل الاختلافات. في الوقت نفسه ، يسمح هذا البروتوكول للمحقق بتقييم الاختلافات المحتملة في نفاذية السفينة وتلفها باستخدام تصوير الأوعية بالفلوريسين. يمكن تحفيز EAU في سلالات الفئران الأخرى – سواء من النوع البري أو المعدل وراثيا – ودمجها مع علاجات جديدة توفر المرونة لدراسة فعالية الدواء و / أو آليات المرض.
Introduction
سيوضح هذا البروتوكول كيفية إحداث التهاب القزحية المناعي الذاتي التجريبي (EAU) في الماوس C57BL / 6J عن طريق حقن واحد تحت الجلد لمستضد شبكية في مادة مساعدة مستحلبة. سيتم تفصيل طرق مراقبة وتقييم تطور المرض من خلال التصوير بالمنظار والفحص النسيجي ، مع تحديد معلمات القياس في الداخل. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم مناقشة تصوير الأوعية بالفلوريسئين ، وهي تقنية لفحص بنية الأوعية الدموية في شبكية العين ونفاذيتها.
يلخص نموذج EAU هذا السمات المركزية لالتهاب العنبية الخلفي غير المعدي لدى البشر فيما يتعلق بالخصائص السريرية المرضية والآليات الخلوية والجزيئية الأساسية التي تدفع المرض. يتم التوسط في EAU بواسطة مجموعات فرعية Th1 و / أو Th17 من الخلايا الليمفاوية CD4 + T ذاتية التفاعل ، كما هو موضح في تجارب النقل بالتبني ومع الفئران المستنفدةIFNγ 1. يأتي الكثير من فهمنا للأدوار المحتملة لهذه الخلايا في التهاب القزحية من دراسة EAU2 حيث يتم اكتشاف كل من خلايا Th1 و Th17 داخل أنسجة الشبكية3. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام EAU كنموذج قبل السريري لتقييم فائدة العلاجات الجديدة في تخفيف المرض. أظهرت الأساليب العلاجية التي نجحت في تعديل مرض EAU بعض الفعالية في العيادة ووصلت إلى حالة معتمدة من إدارة الغذاء والدواء. ومن الأمثلة على ذلك مجموعات من الأدوية المنظمة للمناعة مثل علاجات استهداف الخلايا التائية: السيكلوسبورين ، FK-506 ، و rapamycin4،5،6. في الآونة الأخيرة ، تم أيضا استكشاف التدخلات التي تستهدف مسارات جديدة في هذا النموذج للتحقيق في كل من الآلية والتأثير على نتائج المرض. وتشمل هذه استهداف تنظيم النسخ من خلال بروتينات قارئ الكروماتين Bromodomain Extra-Terminal (BET) ومثبطات P-TEFb3. علاوة على ذلك ، أظهرت الأساليب الأكثر تقليدية مثل مثبط VLA-4 مؤخرا قمعا في EAU عن طريق تعديل الخلايا التائيةCD4 + T 7. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على استهداف خلايا Th17 باستخدام TMP778 ، وهو ناهض عكسي RORγt ، لقمع EAU8 بشكل كبير. علاوة على ذلك ، يوفر هذا النموذج فرصة لدراسة التهاب المناعة الذاتية المزمن في شبكية العين والآليات الأساسية المصاحبة مثل تحضير الخلايا الليمفاوية.
القراءات الأساسية للدراسات قبل السريرية EAU هي التقييم السريري عن طريق إجراء تصوير تنظير قاع الشبكية وأقل تكرارا ، من خلال تقييم سلامة الشبكية عن طريق التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT). ثم يتم إجراء التقييم النسيجي المرضي للشبكية والتنميط المناعي لخلايا الشبكية عن طريق قياس التدفق الخلوي عند الإنهاء. تنظير قاع العين هو نظام تصوير حي سهل الاستخدام يسمح بإجراء تقييم سريري سريع وقابل للتكرار لشبكية العين بأكملها. بالنسبة للتقييمات المناعية الكيميائية ، تعتمد التقنيات على إعداد أقسام الشبكية التي تسمح لنا بدراسة بنية الأنسجة لدرجة الالتهاب والضرر الهيكلي9. سيتم تحديد معايير التقييم وأنظمة التسجيل التقليدية ، لجميع التقنيات المستخدمة ، ضمن هذا البروتوكول. غالبا ما يرتبط مدى الضرر المسجل باستخدام التصوير بالمنظار ارتباطا وثيقا بالتغيرات النسيجية. يوفر هذا النهج المزدوج لرصد وتقييم شدة المرض حساسية أكبر ونتائج قياس أكثر موثوقية.
EAU هو نموذج راسخ وشائع الاستخدام للاختبار قبل السريري والتحقيق في أمراض العين المناعية. هذا النموذج موثوق به وقابل للتكرار مع حدوث مرض بنسبة >95٪ ويولد بيانات شاملة يمكن استخدامها للتحقق من صحة أو رفض العلاجات الجديدة لعلاج مرض التهاب العين الذي يمثل سببا رئيسيا للعمى في سن العمل في جميع أنحاء العالم10.
Protocol
Representative Results
Discussion
النماذج الحيوانية التجريبية هي أدوات ضرورية لدراسة التسبب في المرض والاختبارات قبل السريرية للنماذج العلاجية الجديدة. في البروتوكول الحالي ، ناقشنا منهجية لتحفيز ومراقبة وتسجيل EAU ، وهو نموذج تجريبي لالتهاب القزحية الالتهابي داخل العين. يحتوي نموذج EAU هذا على أكثر من 95٪ من حالات المرض عن…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
حصلت JG على منحة UCL Impact الدراسية وتمويل Rosetrees Trust لدعم CB. تلقت VC منحة تعاونية بحثية من شركة Akari Therapeutics Inc. نود أن نشكر معهد UCL لطب العيون ، وحدة الخدمات البيولوجية وخاصة السيدة أليسون أوهارا وفريقها على دعمهم الفني.
Materials
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
参考文献
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V. Mouse models of autoimmune uveitis. Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
