フィブリン富化およびtPA感受性光血栓性脳卒中モデル
概要
従来の光血栓性脳卒中(PTS)モデルは、主に組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)溶解性治療に対して高い耐性の高密度血小板凝集体を誘導します。ここでは、光活性化のためにトロンビンと感光性色素を同時注入することにより、修正されたマウスPTSモデルが導入されています。トロンビン増強PTSモデルは、血小板:フィブリン血栓を混合し、tPA血栓溶解に対して非常に敏感です。
Abstract
理想的な血栓塞栓性脳卒中モデルには、死亡率の低い比較的単純な外科的処置、一貫した梗塞のサイズと位置、患者と同様の血小板:フィブリン混合血栓の沈殿、線溶治療に対する適切な感受性など、特定の特性が必要です。ローズベンガル(RB)色素ベースの光血栓性脳卒中モデルは、最初の2つの要件を満たしていますが、おそらく血小板に富むがフィブリンに乏しい血栓組成のために、tPAを介した溶解性治療に非常に抵抗性があります。RB色素(50 mg / kg)と血栓下用量のトロンビン(80 U / kg)の組み合わせは、中大脳動脈(MCA)の近位枝を対象とした光活性化のために、フィブリンが豊富でtPA感受性の血栓を生成する可能性があると推論します。実際、トロンビンとRB(T+RB)を組み合わせた光血栓症モデルは、免疫染色と免疫ブロットによって示されるように、血小板:フィブリン混合血栓を引き起こし、一貫した梗塞のサイズと位置を維持し、死亡率を低くしました。さらに、光活性化後2時間以内にtPA(アルテプラーゼ、10mg / kg)を静脈内注射すると、T + RB光血栓症の梗塞サイズが有意に減少しました。したがって、トロンビン増強光血栓性脳卒中モデルは、新規の血栓溶解療法を試験するための有用な実験モデルとなり得る。
Introduction
血管内血栓摘出術とtPA媒介性血栓溶解療法は、米国で年間~70万人の患者を苦しめている急性虚血性脳卒中に対して、米国食品医薬品局(FDA)が承認した唯一の治療法です1。血栓摘出術の適用は大血管閉塞症(LVO)に限定されていますが、tPA血栓溶解療法は小血管閉塞を緩和する可能性があるため、どちらも急性虚血性脳卒中の貴重な治療法です2。さらに、両方の治療法の組み合わせ(例:脳卒中発症から4.5時間以内にtPA血栓溶解療法を開始し、その後血栓摘出術を行う)により、再灌流と機能的転帰が改善されます3。このように、血栓溶解の最適化は、血栓摘出術の時代になっても、脳卒中研究にとって重要な目標であり続けています。
血栓塞栓症モデルは、血栓溶解療法の改善を目的とした前臨床脳卒中研究に不可欠なツールです。これは、機械的血管閉塞モデル(例:管腔内縫合MCA閉塞)が血栓を作らず、機械的閉塞除去後の脳血流の迅速な回復が過度に理想化されているためです4,5。現在までに、主要な血栓塞栓症モデルには、光血栓症6,7,8、局所塩化第二鉄(FeCl3)アプリケーション9、MCA枝へのトロンビンのマイクロインジェクション10,11、MCAまたは総頸動脈(CCA)へのex vivo(マイクロ)塞栓の注入12,13,14、および一過性低酸素虚血(tHI)15,16が含まれます。17,18。これらの脳卒中モデルは、その後の血栓の組織学的組成とtPAを介した溶解療法に対する感受性が異なります(表1)。それらはまた、開頭術の外科的要件(in situトロンビン注射およびFeCl3の局所適用に必要)、梗塞のサイズと位置の一貫性(例、微小塞栓のCCA注入は非常に異なる結果をもたらす)、および心血管系への全体的な影響(例:tHIは心拍数と心拍出量を増加させ、低酸素誘発性末梢血管拡張を補う)にもさまざまである。
RB色素ベースの光血栓性脳卒中(PTS)モデルには、開頭術を使わない簡単な外科的処置、低い死亡率(通常<5%)、梗塞のサイズと位置の予測可能(MCA供給領域内)など、多くの魅力的な特徴がありますが、2つの大きな制限があります。8 最初の注意点は、tPAを介した血栓溶解治療に対する反応が弱いかゼロであることであり、これもFeCl3モデル7,19,20の欠点です。PTSおよびFeCl3脳卒中モデルの2番目の注意点は、その後の血栓が少量のフィブリンを含む高密度の血小板凝集体で構成されており、tPA溶解療法に対する回復力につながるだけでなく、急性虚血性脳卒中患者における血小板:フィブリン血栓の混合パターンからも逸脱していることです21,22。対照的に、in situトロンビン−マイクロインジェクションモデルは、主に重合フィブリンと不確実な血小板の含有量を含む10。
上記の推論を考えると、RBと血栓下用量のトロンビンの混合は、薄くなった頭蓋骨を介したMCA標的光活性化のために、結果として生じる血栓のフィブリン成分を増加させ、tPAを介した溶解治療に対する感受性を高める可能性があると仮定しました。我々はこの仮説を確認し23 、ここでは修正(T+RB)光血栓性脳卒中モデルの詳細な手順を説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
1985年に導入された従来のRB光血栓性脳卒中は、脳梗塞の簡便な外科的処置、低死亡率、高い再現性のための魅力的な限局性脳虚血モデルです。5 このモデルでは、光力学的色素RBは光励起時に血小板を急速に活性化し、血管を閉塞する高密度の凝集体を引き起こします5,8,23。しかし、RB誘発性血栓中の少量…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIHの助成金(NS108763、NS100419、NS095064、HD080429はC.Y.K.、NS106592はY.Y.S.)の支援を受けた。
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
参考文献
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