从高梁叶组织中分离出希石，用于自上而下质量光谱分析潜在的表观遗传标记

干旱的严重程度和频率的增加预计将影响谷物作物的产量^1，2。高梁是一种谷物食品和能源作物，以其抗水限^{水的特殊能力}而闻名于^世。我们正在对干旱压力、植物发育和高梁（高梁双色（L.）莫恩奇植物的表观遗传学之间的相互作用进行机械理解。我们先前的工作已经证明植物和里佐圈微生物群在干旱适应和分子水平^5，6，7的反应之间有很强的联系。这项研究将为利用表观遗传学工程使作物适应未来的气候情景铺平道路。作为理解表观遗传学努力的一部分，我们的目标是研究影响植物生物体内基因表达的蛋白质标记。

组蛋白属于真核生物中高度保存的蛋白质家族，将DNA包装成核糖体作为染色质的基本单位。组蛋白的转化后修改 （PTM） 受到动态调节，以控制色素结构并影响基因表达。像其他表观遗传因素，包括DNA甲基化，石质PTM在许多生物过程^8，9起着重要的作用。基于抗体的检测，如西方污点，已被广泛用于识别和量化石斑点。此外，通过色素免疫沉淀——测序（ChIP-seq）10，可以有效地探究组织PTM和DNA的相互作用。在 ChIP-seq 中，具有特定靶向层蛋白 PTM 的色素通过针对该特定 PTM 的抗体而富含。然后，DNA片段可以从富集的染色质中释放并测序。与靶向层石PTM相互作用的基因区域被揭示出来。然而，所有这些实验严重依赖高质量的抗体。对于一些类结石变异/同源或PTM组合，开发强健的抗体可能极具挑战性（尤其是对于多个PTM）。此外，只有当已知目标的石块PTM时，才能开发抗体。¹¹因此，需要采用非目标的全球平石 PTM 分析的替代方法。

质谱学 （MS） 是一种补充方法，用于描述平石 PTM 的特征，包括未知的 PTM，其中抗体不可用^11，12。在液相色谱 （LC） 分离和 MS 检测之前，成熟的”自下而上”MS 工作流使用蛋白酶将蛋白质消化成小肽。由于类固酮有大量基本残留物（赖氨酸和精氨酸），标准自下而上的工作流程中的丁普辛消化（赖氨酸和精氨酸特有的蛋白酶）将蛋白质切成非常短的肽。短肽在技术上很难通过标准LC-MS进行分析，并且不保存有关多个PTM的连接性和口感学的信息。使用其他酶或化学标签来阻止赖氨酸产生更长的肽，更适合组别石PTM^13，14的特征。

或者，消化步骤可以完全省略。在这种”自上而下”的方法中，完整的蛋白质离子在在线LC分离后通过电喷电离（ESI）引入MS，产生完整的石蛋白形成体的离子。此外，在质谱仪中可以分离和分割感兴趣的离子（即蛋白状体），以产生用于识别和PTM定位的序列离子。因此，自上而下的MS具有保存蛋白突起级信息和捕获多个PTM和终端截断的连接性在同一蛋白回形^15，16的优势。自上而下的实验也可以提供定量信息，并提供完整的蛋白质水平¹⁷的生物标志物的见解。在这里，我们描述了一个从高梁叶中提取石块并通过自上而下LC-MS分析完整发音的协议。

图 1 和图 2中显示的示例数据来自种植后第 2 周收集的高梁叶。 虽然预期产量会有所变化，但此协议通常对特定的样本条件不可知。同样的协议已经成功地用于高梁植物叶组织收集从种植后2，3，5，8，9和10周。