잠재적 인 후성 유전학 마커의 하향 식 질량 분광프로파일링을위한 수줌 잎 조직에서 히스톤의 격리
概要
이 프로토콜은 엔지니어링 가뭄 내성 작물을 돕기 위해 잠재적 후성 유전학 마커역할을 할 수 있는 번역 후 변형 후 프로파일링을 위해 사탕수잎 재료로부터 손상되지 않은 히스톤을 효과적으로 추출하기 위해 개발되었습니다.
Abstract
히스톤은 진핵생물에 있는 고도로 보존된 단백질의 가족에 속합니다. 그(것)들은 크로마틴의 기능적인 단위로 뉴클레오소좀으로 DNA를 포장합니다. 매우 역동적이고 효소에 의해 추가되거나 제거될 수 있는 히스톤의 번역 후 변형(PTM)은 유전자 발현 조절에 중요한 역할을 합니다. 식물에서, 후성 유전학 요인, histone PTM을 포함 하 여, 환경에 그들의 적응 응답과 관련. 후성 유전학 적 제어의 분자 메커니즘을 이해하면 혁신적인 생명 공학 솔루션에 전례없는 기회를 가져올 수 있습니다. 본명, 우리는 핵을 분리하고 사탕수수 잎 조직에서 히스톤을 정화하는 프로토콜을 설명합니다. 추출된 히스톤은 온라인 반전 단계(RP) 액체 크로마토그래피(LC)와 결합된 하향식 질량 분석법(MS)에 의해 온전한 형태로 분석될 수 있다. 동일한 히스톤 프로테오폼에 여러 PTM의 조합 과 스토이치오메트리를 쉽게 식별할 수 있다. 또한, 히스톤 테일 클리핑은 하향식 LC-MS 워크플로우를 이용하여 검출될 수 있으므로 코어 히스톤(H4, H2A, H2B, H3)의 글로벌 PTM 프로파일을 산출할 수 있다. 우리는 가뭄 저항의 후성 유전학 마커를 확인하기 위한 대규모 필드 연구 결과에서 집합된 사탕잎 조직에서 히스톤 PTM을 프로파일링하기 위하여 이전에 이 프로토콜을 적용했습니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 크롬마틴 면역 침전 시퀀싱(ChIP-seq)에 맞게 조정되고 최적화될 수 있으며, 유사한 식물에서 그의 음색 PTM을 연구할 수 있습니다.
Introduction
가뭄의 심각도와 빈도가 증가하면 시리얼 작물1,2의생산성에 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 수쿰은3,4의수중제한조건을 견딜 수 있는 뛰어난 능력으로 유명한 시리얼 식품 및 에너지 작물입니다. 우리는 가뭄 스트레스, 식물 개발 및 사탕수수의 후성 유전학 사이의 상호 작용에 대한 기계적 이해를 추구하고 있습니다 [수줌 바이 컬러 (L.) Moench] 식물. 우리의 이전 작품은 가뭄 적응과 분자수준5,6,7에서반응에 식물과 뿌리 부피 미생물군유전체 사이의 강한 연결을 입증했다. 이 연구는 미래의 기후 시나리오에 작물을 적응에 후성 유전학 공학을 활용하기위한 길을 열 것입니다. 후성유전학을 이해하는 노력의 일환으로, 우리는 식물 유기체 내의 유전자 발현에 영향을 미치는 단백질 마커를 연구하는 것을 목표로 합니다.
히스톤은 크로마틴의 기본 단위로 뉴클레오소로 DNA를 포장하는 진핵생물에 있는 단백질의 높게 보존된 가족에 속합니다. 히스톤의 번역 후 변형(PTM)은 크로마틴 구조를 제어하고 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 동적으로 조절됩니다. DNA 메틸화를 포함한 다른 후성 유전학 적 요인과 마찬가지로, 그의 톤 PTM은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을합니다8,9. 서양 얼룩과 같은 항체 기반 의 소는 널리 그의 톤 PTM을 식별하고 정량화하는 데 사용되어 왔다. 또한, 히스톤 PTM 및 DNA의 상호작용은 크로마틴 면역 침전- 시퀀싱(ChIP-seq)10에의해 효과적으로 조사될 수 있다. ChIP-seq에서, 특정 표적 히스톤 PTM을 가진 크로마틴은 특정 PTM에 대하여 항체에 의해 풍부하게 된다. 이어서, DNA 단편은 농축 된 크로마틴에서 방출되고 시퀀스될 수 있다. 표적 히스톤 PTM과 상호 작용하는 유전자의 영역이 드러난다. 그러나 이러한 모든 실험은 고품질 항체에 크게 의존합니다. 일부 히스톤 변이체/동형학 또는 PTM의 조합의 경우 강력한 항체의 개발은 매우 어려울 수 있습니다(특히 여러 PTM의 경우). 또한, 항체는 표적 히스톤 PTM이 공지되는 경우에만 개발될 수 있다. 11 따라서, 그의 톤 PTM의 표적, 글로벌 프로파일링을위한 대체 방법이 필요합니다.
질량 분광법(MS)은 항체를 사용할 수 없는 알 수 없는 PTM을 포함하여 히스톤 PTM을 특성화하는 보완적인방법이다. 잘 확립된 “상향식” MS 워크플로우는 프로테아제스를 사용하여 액체 크로마토그래피(LC) 분리 및 MS 검출 전에 단백질을 작은 펩타이드로 소화합니다. 히스톤에는 많은 수의 기본 잔류물(리신 과 아르기닌)이 있기 때문에 표준 상향식 워크플로우에서 트립신 소화(리신 및 아르기닌에 특화된 프로테아제)는 단백질을 매우 짧은 펩타이드로 절단합니다. 짧은 펩타이드는 기술적으로 표준 LC-MS에 의해 분석하기 어렵고, 다중 PTM의 연결성 및 스토이치오메트리에 대한 정보를 보존하지 않는다. 다른 효소 또는 리신을 차단하기 위한 화학 라벨링을 사용하면 히스톤 PTMs13,14의특성화에 더 적합한 더 긴 펩티드를 생성한다.
또는 소화 단계를 완전히 생략할 수 있습니다. 이러한 “하향식” 접근법에서, 온전한 단백질 이온은 온라인 LC 분리 후 전기분무분화(ESI)에 의해 MS에 도입되어, 그대로 히스톤 프로테오폼의 이온을 산출한다. 또한, 관심의 이온(즉, 프로테오폼)은 질량 분광계에서 분리및 단편화되어 식별 및 PTM 국소화를 위한 서열 이온을 산출할 수 있다. 따라서 하향식 MS는 프로테오폼 수준의 정보를 보존하고 동일한프로테오폼(15,16)에서다중 PTM 및 단말 절단의 연결을 캡처할 수 있는 장점이 있다. 하향식 실험은 또한 정량적 정보를 제공하고 그대로 단백질 수준17에서바이오마커에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 본 명세서에서는 사탕수수 잎에서 히스톤을 추출하고 하향식 LC-MS로 손상되지 않은 히스톤을 분석하는 프로토콜을 설명합니다.
도 1 과 도 2에 표시된 예제 데이터는 심기 후 2 주차에 수집 된 사탕잎에서 수집됩니다. 수율의 변화가 예상되지만 이 프로토콜은 일반적으로 특정 샘플 조건에 불가지론적입니다. 동일한 프로토콜은 심기 후 2, 3, 5, 8, 9 및 10 주에서 수집 된 사탕 수 식물 잎 조직에 성공적으로 사용되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 사탕수수 잎(또는 일반적으로 식물 잎) 샘플에서 히스톤을 추출하는 방법을 설명합니다. 평균 히스톤 수율은 4-5g 의 사탕수수 잎 재료당 2-20 μg가 될 것으로 예상됩니다. 재료는 LC-MS에 의한 하류 히스톤 분석에 대해 충분히 순수합니다 (대부분 – 20 % 리보솜 단백질 오염이있는 히스톤). 샘플 변형 또는 프로토콜 전체의 잠재적 인 오류 처리 / 오류로 인해 낮은 수율을 얻을 수 있?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 대량 분광 실험에 도움을 준 로널드 무어와 토마스 필모어, 그리고 매튜 먼로에게 데이터 증착을 해준 것에 감사드립니다. 이 연구는 미국 농무부(USDA)의 수상 번호 DE-SC0014081에 따라 수쿰(EPICON) 프로젝트에서 가뭄 대응의 후성유전학 적 통제를 통해 미국 에너지부 (DOE) 생물 및 환경 연구의 보조금에 의해 지원되었다; CRIS 2030-21430-008-00D, 그리고 공동 바이오 에너지 연구소 (JBEI)를 통해, 로렌스 버클리 국립 연구소와 DOE 사이의 DOE (계약 DE-AC02-05CH11231)가 후원하는 시설. 이 연구는 생물환경연구실이 후원하는 과학사용자 시설 DOE 사무소인 환경 분자 과학 연구소(EMSL)(grid.436923.9)를 사용하여 수행되었습니다.
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
参考文献
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