Isolamento dell'istono dal tessuto fogliare di sorgo per la profilazione della spettrometria di massa dall'alto verso il basso dei potenziali marcatori epigenetici

Si prevede che la crescente gravità e frequenza della siccità influirà sulla produttività delle colture^{cerealicole 1,2}. Il sorgo è una coltura alimentare ed energetica di cereali nota per la sua eccezionale capacità di resistere alle condizioni di limitazione^{dell’acqua 3,4}. Stiamo perseguendo la comprensione meccanicistica dell’interazione tra stress da siccità, sviluppo delle piante ed epigenetica delle piante disorgo [Sorgo bicolore (L.) Moench]. Il nostro precedente lavoro ha dimostrato forti connessioni tra microbioma vegetale e rizosfera nell’acclimatazione della siccità e risposte a^{livello molecolare 5,6,7}. Questa ricerca spianerà la strada all’utilizzo dell’ingegneria epigenetica per adattare le colture ai futuri scenari climatici. Come parte degli sforzi per comprendere l’epigenetica, miriamo a studiare marcatori proteici che hanno un impatto sull’espressione genica all’interno dell’organismo vegetale.

Gli istoni appartengono a una famiglia altamente conservata di proteine negli eucarioti che confezionano il DNA in nucleosomi come unità fondamentali di cromatina. Le modifiche post-tras traslazione (PTM) degli istoni sono regolate dinamicamente per controllare la struttura della cromatina e influenzare l’espressione genica. Come altri fattori epigenetici, tra cui la metilazione del DNA, le PTM istono svolgono ruoli importanti in molti processi^{biologici 8,9}. Test a base di anticorpi come le macchie occidentali sono stati ampiamente utilizzati per identificare e quantificare le PTT istonali. Inoltre, l’interazione delle PTM istonali e del DNA può essere efficacemente sondata dall’immunoprecipitazione della cromatina – sequenziamento (ChIP-seq)¹⁰. In ChIP-seq, la cromatina con PTM istonale mirato specifico è arricchita da anticorpi contro quel PTM specifico. Quindi, i frammenti di DNA possono essere rilasciati dalla cromatina arricchita e sequenziati. Vengono rivelate regioni di geni che interagiscono con la PTM istono mirata. Tuttavia, tutti questi esperimenti si basano fortemente su anticorpi di alta qualità. Per alcune varianti/omologhi istoni o combinazioni di PTM, lo sviluppo di anticorpi robusti può essere estremamente impegnativo (specialmente per più PTM). Inoltre, gli anticorpi possono essere sviluppati solo se è noto il PTM istonale mirato. ¹¹ Pertanto, sono necessari metodi alternativi per una profilazione globale non mirata delle PTM istone.

La spettrometria di massa (SM) è un metodo complementare per caratterizzare le PTT istonali, comprese le PTM sconosciute per le^{quali non sono disponibili anticorpi 11,12}. Il consolidato flusso di lavoro MS “bottom-up” utilizza le proteasi per digerire le proteine in piccoli peptidi prima della separazione della cromatografia liquida (LC) e del rilevamento della SM. Poiché gli istoni hanno un gran numero di residui di base (lisina e arginina), la digestione della tripsina (proteasi specifica della lisina e dell’arginina) nel flusso di lavoro standard dal basso verso l’alto taglia le proteine in peptidi molto brevi. I peptidi brevi sono tecnicamente difficili da analizzare per standard LC-MS e non conservano le informazioni sulla connettività e la stechiometria di più PTM. L’uso di altri enzimi o etichettatura chimica per bloccare le lisina genera peptidi più lunghi che sono più adatti per la caratterizzazione delle PTT istono^13,14.

In alternativa, il passaggio di digestione può essere completamente omesso. In questo approccio “top-down”, gli ioni proteici intatti vengono introdotti nella SM mediante ionizzazione elettrospray (ESI) dopo la separazione LC online, producendo ioni delle proteoforme istone intatte. Inoltre, gli ioni (cioè le proteoforme) di interesse possono essere isolati e frammentati nello spettrometro di massa per produrre gli ioni di sequenza per l’identificazione e la localizzazione della PTM. Pertanto, l’MS dall’alto verso il basso ha il vantaggio di preservare le informazioni a livello di proteoforma e acquisire la connettività di più PTM e troncazioni terminali sullo stesso proteoforma^15,16. Gli esperimenti dall’alto verso il basso possono anche fornire informazioni quantitative e offrire approfondimenti sui biomarcatori al livello proteico^{intatto 17}. Nel presente documento, descriviamo un protocollo per estrarre l’istono dalla foglia di sorgo e analizzare gli istoni intatti dall’alto verso il basso LC-MS.

I dati di esempio riportati nella figura 1 e nella figura 2 provengono dalla foglia di sorgo raccolta alla settimana 2 dopo la semina. Sebbene sia prevista una variazione della resa, questo protocollo è generalmente indipendente da specifiche condizioni di campionamento. Lo stesso protocollo è stato utilizzato con successo per il tessuto fogliare vegetale di sorgo raccolto da 2, 3, 5, 8, 9 e 10 settimane dopo la semina.