Imaging di calcio in vivo di successo con un microscopio miniaturizzato head-mount nell'amigdala del topo che si comporta liberamente

Il calcio è un secondo messaggero onnipresente, che gioca un ruolo cruciale in quasi tutte le funzioni cellulari⁸. Nei neuroni, il potenziale d’azione di cottura e l’input sinaptico causano un rapido cambiamento del libero intracellulare [Ca²⁺]^9,10. Pertanto, tracciare i transitori di calcio offre l’opportunità di monitorare l’attività neuronale. I GECI sono potenti strumenti che consentono il monitoraggio [Ca²⁺] in popolazioni cellulari definite e compartimenti intracellulari^11,12. Tra molti tipi diversi di indicatore di calcio a base proteica, GCaMP, una sonda Ca²⁺ basata su una singola molecola GFP¹³, è il GECI più ottimizzato e quindi ampiamente utilizzato. Attraverso più cicli di ingegneria, è stato sviluppato un certo numero di varianti di GCaMP^12,14,15,16. Usiamo uno dei GCAMP sviluppati di recente, GCaMP7b, in questo protocollo¹⁶. I sensori GCaMP hanno notevolmente contribuito allo studio delle funzioni del circuito neurale in una serie di organismi modello come l’imaging dei transitori Ca²⁺ durante lo^{sviluppo 17,}l’imaging in vivo in uno specifico strato corticale^18,la misurazione della dinamica del circuito nell’apprendimento delle attività motorie¹⁹ e l’imaging dell’attività dell’insieme cellulare correlata alla memoria della paura associativa nell’ippocampo e nell’amigdala^20,21.

L’imaging ottico dei GECI presenta diversi^{vantaggi 22}. La codifica genetica consente ai GECI di essere espressi stabilmente per un periodo di tempo a lungo termine in un sottoinsieme specifico di cellule definite dal profilo genetico o da modelli specifici di connettività anatomica. L’imaging ottico consente il monitoraggio cronico simultaneo in vivo di centinaia o migliaia di neuroni negli animali vivi. Sono stati sviluppati alcuni sistemi di imaging ottico per l’imaging in vivo e l’analisi di GECI all’interno del cervello di topi che si comportano liberamente con microscopi miniaturizzati a fluorescenza^{a testa 21,23,24,25}. Nonostante la tecnica di imaging ottico in vivo basata su GECI, lente GRIN e un microscopio in miniatura a testa sia un potente strumento per studiare il legame tra attività e comportamento del circuito neurale, l’applicazione di questa tecnologia all’amigdala è stata difficile a causa di diversi problemi tecnici legati al targeting dell’obiettivo GRIN alle cellule che esprimono GECI nell’amigdala senza causare artefatti di movimento che riducono gravemente la qualità dell’acquisizione di immagini e trovano cellule che esprimono GECI. Questo protocollo mira a fornire una linea guida utile per le procedure chirurgiche di attacco della piastra di base e impianto dell’obiettivo GRIN che sono passaggi critici per l’imaging ottico di calcio in vivo di successo nell’amigdala. Sebbene questo protocollo si rivolge all’amigdala, la maggior parte delle procedure descritte qui sono comunemente applicabili ad altre regioni cerebrali più profonde. Sebbene questo protocollo sia basato su un particolare sistema (ad esempio, Inscopix), lo stesso scopo può essere facilmente raggiunto con altri sistemi alternativi.