Визуализация синегнойной палочки в мокроте больных муковисцидозом

В данном исследовании были разработаны эксперименты по визуализации in vivo структуры Pseudomonas aeruginosa в мокроте детей с муковисцидозом (МВ). Инфекции, вызванные P. aeruginosa, становятся хроническими у 30-40% детей с муковисцидозом; После того, как хронические инфекции укореняются, их практически невозможно устранить1. Изоляты P. aeruginosa, полученные от пациентов с ранней инфекцией, как правило, более восприимчивы к противомикробным препаратам, поэтому их лечат антисинегнойными антибиотиками для предотвращения развития хронической инфекции². К сожалению, не все изоляты P. aeruginosa эффективно выводятся из легких после антибиотикотерапии. Точные механизмы, связанные с недостаточностью антибиотиков, до конца не выяснены. Предыдущие исследования показали, что вариации плотности клеток биопленки, агрегации и продукции полисахаридов могут влиять на эффективность антибиотиков³. P. aeruginosa продуцирует три внеклеточных полисахарида: Pel, Psl и альгинат⁴. Большинство штаммов P. aeruginosa обладают генетической способностью экспрессировать каждый из экзополисахаридов, хотя часто экспрессируется^{преимущественно один} тип полисахаридов 5. Экзополисахарид альгинат ассоциирован с хроническими инфекциями в легких при муковисцидозе, что приводит к мукоидному фенотипу ^6,7. Полисахариды Pel и Psl выполняют множество функций, включая помощь в первоначальном прикреплении и поддержании структуры биопленки, а также обеспечение устойчивости к антибиотикам⁸.

Методы, направленные на визуализацию in vivo структур тканей, разработаны для различных типов образцов ^9,10,11. Совсем недавно они были адаптированы для визуализации микробных сообществ in vivo в мокроте пациентов с муковисцидозом¹². Оптимизация протокола очищения тканей специально для идентификации микробных сообществ в мокроте была разработана DePas et al., 2016¹². Термин MiPACT, который расшифровывается как microbial iидентификация после Passive CLARITY technique, был придуман для очищения мокроты CF^11,12. При использовании методов очистки тканей образцы сначала фиксируются, а затем становятся прозрачными, оставляя при этом присущую им архитектуру нетронутой для окрашивания и микроскопической визуализации¹¹. Фиксация и очистка образцов мокроты CF позволяют исследователям ответить на вопросы, связанные со структурой биопленки, плотностью бактериальных клеток, полимикробными ассоциациями и ассоциациями между патогенами и клетками-хозяевами. Преимущество непосредственного исследования бактерий, сохранившихся в мокроте, заключается в том, что они могут быть проанализированы и визуализированы в контексте, специфичном для хозяина. Несмотря на то, что выращивание in vitro клинических изолятов в лаборатории для экспериментов может быть очень информативным, такие методы не могут полностью воссоздать среду легких при муковисцидозе, что приводит к разрыву между лабораторными результатами и исходами пациентов.

Методы, представленные здесь, могут быть использованы для фиксации и очищения мокроты для визуализации бактерий, будь то у пациентов с муковисцидозом или у пациентов с другими респираторными инфекциями. Специфическим типом окрашивания и микроскопического анализа, описанным в настоящем документе, является флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с последующим связыванием анти-Psl-антител в гидрогеле и последующим анализом с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). После очищения тканей могут быть применены другие методы иммуногистохимии и микроскопии.