Visualização de Pseudomonas aeruginosa no Escarro de Pacientes com Fibrose Cística
概要
Este protocolo fornece métodos para visualização de células bacterianas e polissacarídeos do lócus de síntese de polissacarídeos (Psl) no escarro de pacientes com fibrose cística.
Abstract
A detecção precoce e a erradicação de Pseudomonas aeruginosa nos pulmões de pacientes com fibrose cística podem reduzir a chance de desenvolver infecção crônica. O desenvolvimento de infecções crônicas por P. aeruginosa está associado a um declínio na função pulmonar e aumento da morbidade. Portanto, há um grande interesse em elucidar as razões para a falha na erradicação da P. aeruginosa com antibioticoterapia, que ocorre em aproximadamente 10-40% dos pacientes pediátricos. Um dos muitos fatores que podem afetar a depuração de P. aeruginosa e a suscetibilidade a antibióticos pelo hospedeiro são variações na organização espacial (como agregação ou formação de biofilme) e produção de polissacarídeos. Portanto, estávamos interessados em visualizar as características in situ da P. aeruginosa no escarro de pacientes com FC. Uma técnica de limpeza tecidual foi aplicada às amostras de escarro após a incorporação das amostras em uma matriz de hidrogel para reter as estruturas 3D em relação às células hospedeiras. Após a limpeza do tecido, etiquetas fluorescentes e corantes foram adicionados para permitir a visualização. Hibridização in situ fluorescente foi realizada para a visualização das células bacterianas, ligação de anticorpos anti-Psl marcados fluorescentemente para a visualização do exopolissacarídeo e coloração DAPI para corar células hospedeiras para obter insight estrutural. Esses métodos permitiram a obtenção de imagens de alta resolução da P. aeruginosa no escarro de pacientes com FC por meio de microscopia confocal de varredura a laser.
Introduction
Neste estudo, experimentos foram delineados para visualizar a estrutura in vivo de Pseudomonas aeruginosa no escarro de pacientes pediátricos com fibrose cística (FC). As infecções por P. aeruginosa tornam-se crônicas em 30-40% da população pediátrica com FC; Uma vez estabelecidas, as infecções crônicas são quase impossíveis de serem eliminadas1. Isolados de P. aeruginosa de pacientes com infecção precoce são geralmente mais suscetíveis aos antimicrobianos, portanto, estes são tratados com antibióticos anti-pseudomonas para prevenir o estabelecimento de infecção crônica2. Infelizmente, nem todos os isolados de P. aeruginosa são efetivamente eliminados do pulmão após a antibioticoterapia. Os mecanismos precisos associados à falha antibiótica ainda não foram totalmente elucidados. Estudos prévios demonstraram que variações na densidade celular, agregação e produção de polissacarídeos podem afetar a eficácia dos antibióticos3. P. aeruginosa produz três polissacarídeos extracelulares: Pel, Psl ealginato 4. A maioria das cepas de P. aeruginosa tem a capacidade genética de expressar cada um dos exopolissacarídeos, embora frequentemente um tipo de polissacarídeo seja expresso predominantemente5. O alginato de exopolissacarídeo está associado a infecções crônicas no pulmão da FC, resultando em um fenótipo mucoide 6,7. Os polissacarídeos Pel e Psl têm múltiplas funções, incluindo auxiliar a fixação inicial e a manutenção da estrutura do biofilme, conferindo resistência aos antibióticos8.
Métodos com o objetivo de visualizar in vivo estruturas de tecidos têm sido desenvolvidos para uma variedade de tipos de amostras9,10,11. Mais recentemente, eles foram adaptados para visualizar comunidades microbianas in vivo dentro do escarro de pacientes com FC12. A otimização de um protocolo de limpeza tecidual específico para a identificação de comunidades microbianas dentro do escarro foi desenvolvida por DePas et al., 201612. O termo MiPACT, que significa microbial identification after Passive CLARITY technique foi cunhado para a depuração do escarro de FC11,12. Para as técnicas de limpeza de tecidos, os espécimes são primeiramente fixados, depois tornados transparentes, deixando intacta sua arquitetura inerente para coloração e visualização microscópica11. A fixação e a limpeza de amostras de escarro de FC permitem que os pesquisadores respondam a perguntas relacionadas à estrutura do biofilme, densidade celular bacteriana, associações polimicrobianas e associações entre patógenos e células hospedeiras. A vantagem de examinar diretamente as bactérias que foram preservadas no escarro é que elas podem ser analisadas e visualizadas em um contexto específico do hospedeiro. Embora o crescimento in vitro de isolados clínicos em laboratório para experimentação possa ser muito informativo, tais métodos são incapazes de recriar completamente o ambiente pulmonar da FC, resultando em uma desconexão entre os resultados laboratoriais e os desfechos dos pacientes.
Os métodos aqui apresentados podem ser usados para fixar e limpar o escarro para visualizar bactérias, seja de pacientes com FC ou de pacientes com outras infecções respiratórias. O tipo específico de coloração e análise microscópica aqui descrita é a hibridização in situ fluorescente (FISH), seguida pela ligação de anticorpos anti-PSL dentro do hidrogel e subsequente análise via microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). Após a limpeza tecidual, outros métodos de imunohistoquímica e microscopia também podem ser aplicados.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo deste protocolo é permitir vislumbrar a organização in situ das células de P. aeruginosa no escarro de pacientes com FC. As amostras de escarro devem ser armazenadas a 4 °C até serem processadas, se não puderem ser imediatamente fixadas. Foi demonstrado que o número de células de P. aeruginosa no escarro não muda significativamente se processado em 1 h, 24 h ou 48 h, quando armazenado a 4 °C, embora se deixado a 25 °C por 24 ou 48 h, a contagem de células bacterianas aumentará s…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer à Cystic Fibrosis Foundation que forneceu financiamento para esta pesquisa e à MedImmune por sua generosa doação de anticorpos anti-Psl0096. Para este estudo, as imagens foram realizadas no centro de imagens CAMiLoD da Universidade de Toronto.
Materials
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA – GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
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