24시간 장기 보존 및 지속적인 원격 분석을 사용하여 돼지 모델에서 직소 신장 자동 이식

본 연구는 도착의 원칙에 따라 설계되었다 (동물 연구: 생체 내 실험보고) 지침23. 실험은 동물의 보호에 관한 제도적 지침과 독일 연방법에 따라 수행되었다. 전체 윤리적 제안은 책임 당국 (정부 동물 관리 및 사용위원회, LANUV NRW ) – “Landesamt für Natur, 움웰트 und Verbraucherschutz 노르드하인 – 웨스트 팔렌”, 레클링하우젠, 독일, 의정서 ID : 81-02.04.2018.A051)에 의해 승인되었다. 본 연구의 모든 동물은 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 대한 “실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드”(8 판, NIH 간행물, 2011, 미국)와 지침 2010/63 / EU의 원칙에 따라 인도적 치료를받았습니다 (유럽 연합 (EU) 공식 저널, 2010). 독일 의 한 육상 돼지는 위생적으로 최적화 된 장벽 사육 시설 (하인리히스 GbR, 하인스버그, 노르드하인 – 웨스트 팔렌)에서 얻었다. 도 1은 설명된 실험 프로토콜의 요약을 묘사합니다. 1. 동물 과 주택 이 프로토콜에 여성 독일 육상 돼지 (또는 비교)를 사용합니다. 14일 전에 연구시설에 동물을 납품하여 적응을 위해(원격 측정 이식) 12h 빛과 암사이클을 갖춘 온도 및 습도 조절 장벽 환경에서 동물을 수용한다(그림 2). 등록된 데이터를 전망실에 있는 PC로 직접 전송할 수 있는 방 천장에 두 개의 원격 측정 수신기를 마운트합니다. 수의학 장교와 담당 동물 관리인 (8 시간 마다 및 주문형)에 의해 정기적으로 방문하는 동안 동물을 시각적으로 관찰해야합니다.참고: 또한, 이 실험에서는 로컬 네트워크에 연결된 통합 열 화상 진찰이 있는 실시간 카메라 영상을 사용하였다. 본 연구에 사용된 주택 시설의 세부 사항은 그림 2에묘사되어 있습니다. 2. 기본 기술과 일반적인 절차 수술 전에 하룻밤 동안 동물을 빨리. 아자페론 (4 mg/kg)과 아트로핀 (0.1 mg/kg)의 초기 근육 주입에 의해 전조, 케타민의 주입 에 의해 (15 mg/kg) 10 분 후. 사전 약물 치료 후, 동물을 무게와 중앙 또는 시설 마취 준비 실로 주택 시설에서 직접 전송. 18 G 말초 정맥 카테터를 사용하여 큰 귀 정맥 중 하나를 캐누레이. 표준 심전도 및 펄스 옥시메트리로 동물을 모니터링합니다. 프로포폴 (3 mg / kg)으로 마취를 시작합니다. 후두로 성대를 노출하고 7.5mm 내장 튜브를 삽입합니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 커프스가 공기로 차단됩니다. 오로 위 배수관을 삽입하여 위장에서 유체와 공기를 제거합니다. 요도를 통해 오줌 카테터를 삽입합니다. 그 후, 외과 절개 부위에 피부를 다듬는다. 수술 중 각막건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용하십시오. 오로트라세이션 후 이소플루란(최종 만료 1.45-2.0 Vol.%) 및 펜타닐(3-7.5 μg/kg/h)으로 마취를 유지한다. 가열 패드와 따뜻한 공기를 사용하여 동물의 활성 수술 중 온도 제어를 보장합니다. 직장 프로브를 삽입하여 체온을 모니터링합니다(목표 온도 36.5°C – 37.5°C). 세풀옥시메(35 mg/kg i.v.)를 사용하여 항생제 예방을 투여한다. 4mL/kg/h의 링거 용액을 주입하고 피부 절개 후 8mL/kg/h로 증가합니다. 귀 정맥 접근을 통해 판토프라졸(40 mg i.v.)의 예방 복용량을 투여하십시오. 외과 적 염증 및 항패 증의 일반적인 원칙에 따라 멸균 조건에서 모든 수술 절차를 수행. 포비도오요오드 용액으로 수술장을 소독하고 수술용 커튼으로 덮습니다. 3. 원격 분석 이식 프로토콜의 섹션 2에 따라 설명 된 단계에 따라 수술을위한 동물을 준비하고 감소 심박수와 동물의 의식적 운동의 부족에 의해 적절한 마취를 확인합니다. 개별 기준선 실험실 값을 결정하기 위하여 혈액과 소변 견본을 수집합니다. 영구 마커를 사용하여 절개 사이트를 표시합니다. 원격 측정 트랜스폰더의 동맥 센서를 이식하려면 사타구니에 3-4cm 절개를 수행하십시오. 360° 방식으로 동맥을 노출하고 해부합니다. Overholt 클램프를 사용하여 동맥 아래의 두 용기 루프를 통과하여 모기 클램프로 고정하십시오. #11 블레이드 메스를 사용하여 동맥 절제술을 한 후 동맥 센서를 삽입하십시오. 단일 매듭 봉합사5-0 폴리 프로필렌 봉합사를 사용하여 동맥 절제술을 닫고 이러한 봉합사 중 하나를 사용하여 동맥 센서를 확보하십시오. 동물의 왼쪽 측면에 3-4cm 큰 절개를 하고 무딘 해부에 의해 트랜스 폰더에 대한 피하 파우치를 만듭니다. 원격 측정 트랜스폰더를 측면에 터널로 고정하고 근육 근막 (3-0 폴리 프로필렌, 단일 매듭)에 고정합니다. 빨강과 흰색 심전도 전극을 흉부의 오른쪽과 왼쪽으로 터널링합니다. 두 개의 1cm 절개를 하고 근육 조직내 전극을 고정하여 단일 매듭 봉합사(3-0 폴리글락틴)로 좋은 심전도 신호를 보장합니다. 원격 분석 데이터의 등록을 시작하고 다양한 신호(예: 트랜스폰더 체 자체에 의해 등록된 체온, 동맥 혈압 및 심전도 신호)를 확인합니다. 사타구니의 절개를 닫고, 왼쪽 측면과 근육과 피하 봉합사(3-0 폴리글랙틴)를 사용하여 두 개의 작은 토라칼 절개를 닫고 흡수성이 없는 모노필라멘트 봉합사(예를 들어, 2-0 Prolene)를 사용하여 피부를 닫습니다. 스프레이 필름 드레싱을 사용하여 절개 부위를 밀봉하십시오. 이 때 동물은 남은 연구 기간 동안 착용하는 지정된 돼지 재킷을 착용하도록 준비합니다. 모든 외과 적 개입 에 따라 깨끗한 재킷으로 재킷을 교체하십시오.참고: 안정적인 기준선 데이터를 기록하려면, 원격 측정 트랜스폰더는 인덱스 수술 14일 전에 이식됩니다(왼쪽 신장 절제술, 토론참조). 4. 신장 절제술 및 신장 이식 검색 섹션 2에 설명된 절차에 따라 이식 검색 수술을 위해 동물을 준비하십시오. 마취의 유도 후, 외부 경정맥을 수납. 수술장의 멸균 소독에 따라, 경정맥 홈의 오른쪽에 4cm 절개가 만들어집니다. 피하 조직과 근육을 해부하여 외부 경정맥을 노출시합니다. 360° 방식으로 정맥을 노출하고 해부합니다. 오버홀트 클램프를 사용하여 정맥 아래 의 두 용기 루프를 통과하여 모기 클램프로 고정합니다. 동물의 뒤쪽으로 경마 카테터를 터널. 이를 위해 돼지를 왼쪽에 놓습니다. 셀딩거 방법을 사용하여 경마 카테터를 삽입합니다. 정맥의 개구부를 닫고 5-0 폴리 프로필렌 봉합사를 사용하여 카테터를 고정하십시오. 두 층에서 절개를 닫습니다 (예를 들어, 근육과 피하용 폴리 글랙틴 3-0 및 피부에 대한 2-0 폴리 프로필렌). 여러 봉합사 (2-0 폴리 프로필렌)로 피부에 카테터를 고정합니다. 무료 포부와 주사를 위해 경정맥 카테터를 테스트합니다. 그 후, 정맥 캐뉼라에서 중앙 정맥 선으로 정맥 라인을 전환합니다. 외과 소독 및 드레이핑에 따라 중형 복강경 절제술을 수행하여 복부 (25-30cm)를 엽니다. 표준 복부 리트랙터를 사용하여 수술장을 노출하십시오. 결장과 작은 창자를 덮기 위해 젖고 따뜻한 복부 수건을 사용합니다. 두 번째 조수에게 신장과 혈관 구조를 노출하는 오른쪽 헤미 복부의 방향으로 장을 잡도록 요청하십시오. 복막층을 열고 단극성 소작, 양극성 집게 및 미세 가위를 사용하여 모든 부착 조직에서 왼쪽 신장과 요관을 해부합니다. 리게이트와 왼쪽 요관(3-0 폴리글락틴)을 나누고 10~12cm 이상의 세그먼트를 남깁니다. 왼쪽 신장 정맥과 동맥의 해부를 열등한 베나 카바와 대동맥으로부터 유래하여 각각 완료하십시오.참고: 이 해부학 적 지역에서 큰 림프관의 부상과 개방을 피하십시오. 또한 베니 카바에서 유래에 가까운 신장 정맥에 합류 하는 azygo-lumbar 정맥에 잠재적인 부상을 알고 있어야 합니다. 두 합자 (3-0 폴리 글랙틴) 사이에 azygo-lumbar 정맥을 해부하고 리게이트합니다. 얼음 그릇과 멸균 커버를 사용하여 백 테이블 해부를 준비하십시오. 이식 신장을 검색하려면 신장 동맥과 대동맥과 정맥에 가까운 혈관을 혈관 클램프로 고정시하십시오. 클램프에 가까운 가위로 혈관을 절단하여 신장 이식편을 제거한 다음 신장을 뒷좌석 팀에 넘겨주게 합니다. 5-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 신장 동맥의 그루터기를 닫습니다. 5-0 폴리프로필렌으로 2층 연속 봉합사를 사용하여 신장 정맥을 닫습니다. 혈관 클램프를 제거합니다. 출혈 또는 림프 누출에 대 한 영역을 확인 한 후, 4 층에서 복부를 닫습니다.참고: 회대: 3-0 폴리글락틴 실행 봉합사; 근막: 0 폴리글락틴 실행 봉합사; 피하 층: 3-0 폴리글락틴 실행 봉합사; 피부: 신장 검색 수술 후 피부 스테이플러, 다음 날 복부를 다시 열 수 있도록 하고 2-0 폴리 프로필렌 단일 매듭 봉합사 후 확실한 폐쇄를 위한 이식 절차. 멸균 상처 드레싱을 적용 한 후, 하우징 시설에 동물을 반환하고 내막 경전 다음 복구 할 수 있습니다. 수술 후 진통의 경우, 부프레노르핀(0.05- 0.1 mg/kg)을 자동 이식할 때까지 8시간마다 근육질로 사용하십시오. 5. 백 테이블 및 장기 보존 이식 검색 후, 즉시 표준 14 G (오렌지) 주변 카테터를 사용하여 신장 동맥을 수거하고 3-0 폴리 글랙틴에서 준비 된 지혈대를 사용하여 수정합니다. 감기 장기 보존 용액으로 신장을 헹구는 다. 장기 보존 용액 500mL로 플러시한 후, 동맥 캐뉼라를 제거하고, 신장 이식편을 멸균 기관 가방에 싸서, 컴퓨터 제어 냉각 회로를 사용하여 4°C에서 24h의 표적 감기 허혈시간(CIT)을 사용하여 장기 보존 용액에 보관한다.참고: 4°C 일반 식염수 용액의 500mL를 사용하여 간단한 보존 후 플러시를 사용하는 것이 좋습니다. 6. 콘트라탈 신장 절제술 및 직교 신장 자동 이식 수령인 수술 중, 제한된 신장 대사에 약물 전 약물 및 초기 마취를 적응시키고 케타민의 사용을 피하십시오. 유도는 프로포폴 (3-5 mg /kg i.v.), 미다졸람 (0,25 mg /kg i.v.), 그리고 아트로핀 (0.1 mg / kg i.m.)으로 수행됩니다. 그 후 수술 전 제제는 섹션 2에 설명된 절차와 동일합니다. 이소플루란 (최종 만료 1.45-2.0 Vol.%) 및 펜타닐 (3 – 7,5 μg /kg/h) 및 프로포폴 (2 – 4 mg /kg/h)으로 마취를 유지합니다. 심전도, 맥박 산소측정, 직장 온도 및 원격 측정 트랜스폰더의 기능을 지속적으로 모니터링하고 모니터링합니다.참고: 엄격한 마취 및 혈압 조절은 이식 절차 중에 매우 중요합니다. 드문 경우 원격 측정 트랜스폰더에 등록된 동맥 혈압 신호가 동물의 척추 위치로 인해 만족스럽지 않은 경우 경피성 천자 및 셀딩거 기술을 사용하여 올바른 대퇴동맥에 추가 동맥 카테터를 배치합니다. 멸균 드레이핑 에 이어, 중앙 복강경 절제술을 다시 열고 복부 리트랙터를 사용하여 수술장을 노출시다. 결장과 작은 창자는 손상되지 않은 오른쪽 신장을 드러내기 위하여 복부의 왼쪽에 두습니다. 기증자 절차와 유사하게, 주변 조직에서 금단측 신장및 그것의 혈관을 해부하십시오. 해부학에 대한 충분한 혈관 길이를 보장하기 위해 신장 동면 방향으로 오른쪽 신장 정맥과 신장 동맥을 해부. 혈관 클램핑 5 분 전에, 정맥 (100 I.U./ kg)을 정맥으로 낫륨 헤파린을 주입하십시오. 혈관 클램프를 사용하여 오른쪽 신장 동맥과 오른쪽 신장 정맥을 고정합니다. 오른쪽 신장이 제거됩니다. 혈관은 해부학을 시작하기 전에 무결성을 검사합니다. 보존된 이식성 신장을 복부에 넣고 정맥 및 동맥 해부학을 시작합니다. 이 시점부터 80-90mm Hg 이상의 평균 동맥 압력을 유지하여 재관류 에 따른 신장 이식식의 조기 관류를 보장하십시오. 적절한 체적 관리에 의해 부분적으로 이를 달성하고 노르피네프린의 투여에 의해 부분적으로 달성(0.1 – 1.0 μg/kg/min 효율을 모니터링하기 위한 평균 동맥 혈압 및 심박수를 이용한 지속적인 주입으로서). 신장 정맥의 종단 간 해부학수행: 5-0 폴리프로필렌을 사용하여 두 개의 코너 스티치를 배치한 후, 백 월을 연속적인 방식으로 봉합합니다. 두개골 모서리 스티치를 묶고 뒷벽에 사용되는 스레드와 함께 묶습니다. 뒤쪽 벽을 마친 후 두개골 모서리 스티치를 사용하여 앞벽을 두개골-caudal 방향으로 봉합합니다. 아페라린화된 식염수 용액(100 I.U./mL)으로 정맥을 플러시합니다. 코달 코너 스티치를 묶습니다.참고: 기증자와 받는 사람 측 간의 크기 불일치의 경우, 작은 성장 인자를 사용하여 넓고 충분한 해부학을 보장할 수 있습니다. 돼지 수선 정맥 가지의 가능한 많은 변화가 있습니다. 복잡한 정맥 해부학의 경우 수정 된 해부학 접근 방식이 필요합니다 (그림 3참조). 신장 동맥의 종단 간 해부학을 수행하십시오. 6-0 폴리프로필렌 두개골 코너 스티치를 사용하여 동맥 해부학을 수행합니다. 나중에 제거되는 코너 스티치를 지원하는 추가 caudal을 배치하는 것은 선택 사항입니다. 낙하산 기술을 사용하여 연속적인 방식으로 백 월을 봉합합니다. caudal 모서리에 도착 한 후 두 번째 코너 스티치를 제거합니다 (해당하는 경우). 이중 무장 6-0 폴리 프로필렌 봉합사의 다른 끝으로 전면 벽을 봉합. 동맥을 분리된 식염수 용액(100 I.U./mL)으로 플러시합니다. 카우달 모서리에 두 개의 스레드를 묶습니다. 목표 따뜻한 허혈 시간으로 두 해부학을 수행하는 데 필요한 시간을 기록 & 40 분. 정맥 혈관 클램프를 열고 그 이후에 동맥 클램프를 열어 신장을 재페퓨즈합니다. 상당한 출혈을 확인하십시오. 해부학에서 중요한 출혈이 관찰되지 않는 경우, 신장 이식편을 풀고 레퍼퍼드 된 접목을 덮고 복부에 따뜻한 정상 식염수 용액을 부어. 필요한 경우 이식편을 재배치하여 균일한 재관전을 보장하고 혼잡을 방지합니다. 신장 동맥과 동맥 해부학의 외부에 국소적으로 파파베린을 관리 (5 mL 희석). 레퍼퓨전 후, 250mL의 20% 포도당 용액을 주입하여 삼투성 다이레시스를 유도한 다음 1회 투여량 80 mg의 후로즈미드를 투여한다.참고: 이에 따라 초기 소변 생산이 관찰될 수 있습니다. 오줌 배수를 보장하기 위해, 동물의 오른쪽 측면의 복벽을 통해 12 개의 프랑스 소아 소변 카테터를 소급하여 전달하십시오. 합자(2-0 폴리글락틴)를 사용하여 요관에서 카테터를 확보하고 2mL 식염수로 카테터를 차단합니다. 추가 봉합사는 복벽 (2-0 폴리 프로필렌)의 복막에 요료를 적응하고 고정하는 데 사용됩니다. 카테터는 또한 적어도 두 개의 단일 매듭 봉합사 (2-0 폴리 프로필렌)로 피부에 고정됩니다. 신장 상동맥층을 닫아 신장 이식및 혈관 상모(3-0 폴리글락틴)의 신장 이식편 탈구 및 꼬임 방지를 위해 닫습니다. 이식 검색에 대해 앞에서 설명한 것과 유사한 4층 방식으로 복부를 닫습니다. 복부 폐쇄 에 따라 OR 테이블에 노노더미아를 유지합니다.참고: 동물이 깨어 있고 경향이 있는 위치에 있을 때까지 동맥 혈압은 80mm Hg 이상 유지되어야 합니다. 복부 폐쇄 에 이어, 신장 이식의 적절한 동맥 및 정맥 관류를 보장하기 위해 색상 도플러 초음파를 사용합니다(도 4). 동물이 완전히 깨어 있고 자발적으로 걷고 마실 때까지 동물을 면밀히 모니터링하십시오. 동물은 복구 단계에서 링거 용액 1 L을 받습니다. 그 후, 하우징 시설의 상자에 동물을 반환합니다. 7. 후속 조치, 샘플 및 데이터 수집 동물들이 자발적으로 마실 수 있는 즉시 물 광고 리비툼을 제공합니다. 수술 후 1일부터 단단한 음식을 제공합니다. 수술 후 진통의 경우, 72h에 대해 8시간마다 근육질로 부프레노르핀(0.05- 0.1 mg/kg)을 투여하고, 판소졸(40mg i.v.)을 72h로 하루에 한 번 투여한다. 실험이 끝날 때까지 전체 관찰 기간 동안 항생제 치료(cefuroxime 35 mg/kg i.v. 매일 2배) 및 혈전증 예방(수술 후 1일부터 아세틸살리실산 500 mg)을 제공한다.참고: 출혈 합병증이 발생하면 아스피린이 중단됩니다. 관찰 기간 동안 연속 원격 분석 데이터를 등록합니다. 동물은 수의장교 및/또는 숙련된 수의학 기술자에 의해 적어도 8시간마다 방문되고 그들의 임상 상태는 동물의 임상 상태에 의해 요구되는 경우에 조기에 실험을 종료하는 기초로 사용되는 점수 시트를 사용하여 평가되는지 확인합니다.참고: 이러한 소위 인도적 끝점 기준은 이전에 설명된24로정의됩니다. 중앙 정맥 라인과 경피 오줌 카테터를 사용하여 매일 샘플 수집을 수행하십시오. 매일 2배(2,000mL) 오줌 봉투를 바꿉니다. 샘플 수집 또는 유체 또는 약물의 투여에 따라, 폐색을 방지하고 새로운 멸균 캡으로 커버하기 위해 모든 사용 사이에 헤파리니화 식염수 용액 (100 I.U./mL)으로 중앙 정맥 카테터를 차단합니다. 5~7일의 관찰 기간에 따라 신장 이식술의 재발, 샘플 수집 및 절제에 따라 깊은 마취에서 동물을 희생한다. 희생은 펜토바르비탈(50-60 mg/kg i.v.)의 단일 주사를 사용하여 수행됩니다.참고: 3R 원칙에 따라 희생된 동물의 나머지 장기와 조직은 사내 기관에서 다양한 전 생체 연구 및 교육 목적으로 사용될 수 있습니다.