EFA 감소 및 분산을 통한 SEC-SAXS 데이터 분석

1. 단백질 발현, 정제 및 SEC-SAXS 측정은 게시된프로토콜(13)을 기반으로 합니다. 간략한 인라인 SEC-SAXS 데이터 수집 프로토콜(Brennich et al.6)을참조하십시오. SEC 실행 버퍼(20m Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl)의 최소 2열 볼륨으로 SEC 열을 상화합니다. 부분 dsDNA(TCAGAAGATAACAGCGGTTTAGCC 및 GGCTAACCGCTGTTCTT)를 20% 초과하는 8\u201210 mg/mL에서 E9 엑소스마이너스 샘플 50 μL을 준비한다. E9 엑소마이너스는 12± 6nM의 KD와 결합합니다(보충 데이터참조). 0.3mL/min의 SAXS 측정을 위한 유량 셀과 함께 SEC 열(S200 증가)에 이 믹스의 50 μL을 주입합니다. 1s 노출로 1000 프레임을 수집합니다.참고: BioSAXS 빔라인 BM29에서 유럽 싱크로트론 시설(ESRF)에서 개별 프레임은 EDNA 프레임워크14내에서 자동으로 독립적으로 처리됩니다. 데이터 수집 후 ISPyB데이터베이스(20)를 열고 데이터 수집 탭 에서 이동 버튼을 눌러 데이터 세트및 자동분석(21)의결과에 액세스할 수 있다. 데이터를 다운로드합니다. 2. 기본 데이터 분석 Java 기반 프로그램 열기 분산 IV ( 재료 테이블) 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 데이터에 대한 배경 뺄셈을 수행합니다.SEC 탭을 엽니다. 감소된 데이터파일(*.dat)을”아래 데이터 드롭” 창에 드래그하고 놓습니다. 파란색 레이블이 표시된 출력 Dir 버튼을 클릭하여 출력 디렉토리 “Out Dir ::”을 설정합니다.참고:nm-1에서데이터가 수집된 경우 파일을 창이나 빼기 탭에 떨어뜨릴 때 변환 상자를 선택(패널 왼쪽 하단)해야 합니다. 실험 세부 사항을 편집하고 세부 정보 편집 버튼을 사용하고 가능한 한 많은 필드를 작성할 수 있으며, 여기에는 데이터를 수집하는 데 사용된 소스/빔라인 섹션, 수집 매개 변수 및 샘플 세부 정보가 포함됩니다. 이러한 내용은 데이터와 함께 저장되며 향후 발행물의 “데이터 수집 매개 변수” 섹션을 보다 쉽게 채울 수 있습니다. 저장 상자에 샘플 이름을 입력합니다. TRACE를 클릭합니다.참고: 두 가지 효과가 있습니다. 첫째, 데이터에 대한 *.sec 파일을 만듭니다. 이것은 별도의 * .dat 파일에서 모든 실험 관측을 대조하는 단일 텍스트 파일입니다. 또한 *.sec 파일에는 버퍼 백인 프레임의 평균 집합, 평균에 사용되는 모든 프레임뿐만 아니라 전체 SEC-SAXS 실험에서 버퍼 백 빼는 프레임이 포함되어 있습니다. 둘째, 프레임 수대와 일체비율을 배경에 플롯하는 신호 플롯이 만들어집니다. 이는 버퍼 빼기에 대해 평균된 선택한 프레임(회색)을 보여 주는 것입니다. 평균 버퍼의 점은 데이터의 전체 범위에서 결정됩니다. 그러나, 제대로 정의된 배경이 제대로 평형화되거나 더러운 컬럼 또는 모세관파울(22)으로인해 발생할 수 있으므로 평균화에 대한 버퍼 프레임을 수동으로 선택하는 것이 좋습니다. 버퍼 프레임을 수동으로 선택합니다. 버퍼 지우기를 클릭한 다음 추적 곡선에서 왼쪽 클릭 드래그가 있는 버퍼 영역을 다시 선택합니다. 이상적으로는 약 100프레임의 SEC 열의 보이드 볼륨 이전에 평평한 영역이어야 합니다. 버퍼 설정을 클릭한 다음 업데이트하여 몇 분 정도 걸릴 수 있는 *.sec 파일을 다시 계산합니다. 관심 영역(ROI)을 식별합니다. 신호 플롯에서 왼쪽 클릭 드래그를 통해 관심 피크의 영역을 선택합니다.참고: 오른쪽 패널에 세 개의 플롯이 채워집니다. 상위 두 플롯은 그들 사이를 이동하는 십자선과 연결되어 있으며, 두 번째 신호 플롯(오른쪽 상단)은 선택한 ROI만 표시하며, 각 프레임의 빨간색과 해당 열 맵의 강도는 Durbin-Watson 자동 상관 관계 분석에 따라 색상이 지정된 각 프레임에 대한 잔류를 보여줍니다. 높은 유사성의 영역은 컬러 시안 (Durbin-Watson, d = 2) 다른 프레임은 비유사성의 심각도에 따라 분홍색에 어두운 파란색을 따라 마지막으로 빨간색에 따라 (d > 2). 아래쪽 플롯은 중앙 선택된 프레임에 대해 0으로 된 I 대 q 곡선입니다(또한 세로 선으로 표시됨). 화살표 키를 사용하여 빼진 프레임을 탐색할 수 있습니다. I 대 q 플롯은 SEC 실험에서 빼어진 프레임의 품질을 보여줍니다. 병합할 프레임을 선택합니다. 히트 맵 플롯의 십자선을 클릭하여 병합에 사용할 프레임의 하위 집합을 선택합니다. 십자선은 십자선의 오른쪽 하단에 떨어지는 주로 시안의 삼각형 영역을 식별합니다. 마우스 클릭을 사용하여 이러한 프레임을 선택한 프레임으로 설정하고 위의 신호 플롯의 해당 영역에서 프레임을 강조 표시합니다. 이러한 프레임은 일반적으로 안정적인 Rg가 있는 영역을 강조 표시해야 합니다.참고: 필요에 따라 왼쪽 클릭 드래그로 열지도를 확대하고 왼쪽 클릭으로 오른쪽으로 스와이프하여 축소합니다. 선택한 프레임에 만족하면 병합을 클릭합니다. 이렇게 하면 빼진 프레임을 병합하여 분석 탭에 표시합니다. 3. 데이터 감소 deconvolution 프로그램 (예 : BioXTAS Raw 2.0.0)을 엽니 다. 디콘볼루션 프로그램에서는 파일 탭 아래, 제어판에서데이터 집합을 로드하여 접이식 기호를 사용하여 데이터를 찾거나 위치를 복사하여 주소 표시줄에 붙여넣습니다.참고: 폴더에 원시 *.dat 파일만 포함되어 있는지 확인하고 처리된 데이터 파일이나 평균 데이터 파일이 포함되어 있지 않은지 확인합니다. 모든 *.dat 파일을 강조 표시하고 플롯 시리즈 버튼을 누르면 통합 강도 대 프레임 번호의 플롯이 “시리즈 플롯”에 그려집니다. 제어판에서 시리즈 탭을 선택한 다음 클릭하여 곡선을 강조 표시합니다. 제어판 베이스의 버튼을 사용하여 LC 분석 팝업 창을 엽니다. 이 창은 다양한 분자 모형 (단백질 또는 RNA)를 선택하는 것과 같은 몇몇 선택권에 접근을 제공합니다. 또한 사용자가 플롯에 대한 버퍼 영역을 선택할 수 있습니다. 첫 번째 인스턴스에서 자동을 클릭합니다.참고: 불안정한 기준선으로 인해 실패하면 버퍼 영역을 최적화하기 위해 “영역 추가”가 실패할 수 있습니다. 이렇게 하면 버퍼 상자에 버퍼에 사용할 프레임 번호를 수동으로 추가할 수 있는 작은 상자가 채워집니다. 또는 “선택”을 클릭하여 플롯에서 영역을 선택할 수 있는 옵션을 제공합니다. 영역을 찾거나 시작 위치에 대해 한 번 왼쪽 단추로 클릭하고 커서를 다음 위치로 이동하고 다시 클릭합니다. 두 개 이상의 버퍼 위치를 추가해야 할 수 있습니다. 버퍼 설정을 클릭하면 곡선이 빼고 RG가 SEC 피크에서 계산됩니다. 팝업 상자가 나타나면 확인을 클릭합니다. 진화하는 요인 분석(EFA)을 시작하려면 아래쪽의 강조 표시된 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 제어판 다음을 선택합니다. Efa 메뉴에서.데이터 집합의 단일 값 분해(SVD)를 표시하는 팝업 창이 열리는지 확인합니다. 컨트롤 상자에서 프레임 사용 상자를 선택하여 전체 피크 영역이 강도 플롯에 덮여 있는지 확인합니다. 오른쪽 상단의 “단수 값” 플롯은 기준선 위의 단수 값(별도의 피크/종)의 강도를 표시합니다.참고: 기준선 위에 있는 점의 수는 존재하는 산란 종의 수를 나타냅니다. 중요한 평면 영역/기준선에 단수 값의 상대크기라는 주의할 수 있습니다. 단일 값 수의 유효성을 검사하려면 아래쪽 Auto상관 플롯을 사용합니다. 이것은 오른쪽 및 왼쪽 단일 상관 관계 벡터를 보여줍니다. 다음을클릭합니다.참고: 이는 기본적으로 용액의 벡터에 대한 산란 또는 농도 프로파일을 나타냅니다. 절대 크기가 벡터의 중요성을 나타내는 위치입니다. 중요한 구성 요소는 1 근처에 자가 상관 관계가 있습니다 (엄지 손가락 차단 규칙은 >0.6\u20120.7입니다). RAW는 도움이 되는 것으로 계산하고 필요한 경우 변경할 수 있지만 왼쪽 하단의 #Significant SV 상자에 표시됩니다. 여러 개의 단일 값(예: 4+)이 있는 경우 구성 요소 중 2개 또는 3개만 보고 사용된 데이터의 범위를 변경해야 할 수 있습니다. 구성 요소 수가 적을수록 EFA 분석이 더 쉬워지지만 데이터를 적게 사용하는 데 드는 비용이 듭니다. 비슷한 왼쪽 및 오른쪽 단수 벡터가 일치하는 복잡한 상황에서는 상당한 SV 수를 줄이고 왼쪽 및 오른쪽 단수 벡터가 유사할 때까지 사용되는 프레임 수를 줄입니다. 각 벡터에 대한 앞뒤로 길찾기에서 플롯을 생성하여 EFA가 계산되었는지 확인합니다. 이러한 플롯은 구성 요소가 선택한 SEC-SAXS 데이터에 대한 솔루션 프로파일을 시작(앞으로 플롯) 및 종료(뒤로 플롯)하는 시기를 보여 준다. RAW는 이러한 범위를 식별하려고 시도합니다. 각 원이 기준선으로 상승하거나 떨어지는 변곡점이 시작될 수 있도록 카운터 옆의 화살표를 사용하여 이러한 화살표를 변경합니다. 다음을클릭합니다.참고: EFA의 마지막 단계는 SVD 벡터를 다시 분산 곡선으로 바꿉니다. 창 왼쪽에 앞에서 정의된 범위가 맨 위에 플롯됩니다. 이러한 범위는 단수 벡터를 다시 분산 곡선으로 회전할 위치를 정의하는 제약 조건입니다. 오른손 패널은 각 분리된 피크에 대해 이러한 해당 산란 곡선 프로파일을 표시합니다. 용출 프로파일과 평균 오차 가중 치2에대한 플롯을 대표해야 각 피크의 농도에 대한 플롯. chi2 플롯은 원래 데이터 집합으로 설정된 deconvolution 데이터를 측정합니다. 이상적으로, 이것은 평평할 것입니다, 그러나 스파이크는 수시로 볼 수 있습니다. 구성 요소 범위 컨트롤을변경하여 스파이크를 줄이거나 제거하려고 시도하고, 먼저 스파이크에 해당하는 프레임(chi2 plot)을 식별한 다음, 이 프레임을 포함하는 범위 컨트롤에서 화살표를 사용하여 해당 범위를 위 또는 아래로 이동합니다.참고: 이는 스파이크를 증가하거나 줄이면 응답을 생성해야 합니다. 스파이크 프레임이 두 개 이상의 구성 요소에 있는 경우 각 구성 요소 간에 약간의 시행 착오가 필요할 수 있습니다. 최소 치2를 달성한 경우 다시클릭하여 유효성 검사 검사를 수행하면 이전 창에서 변경 사항이 원래 EFA 플롯을 크게 변경했는지 확인할 수 있습니다. 여전히 유효해 보이는 경우 다음을클릭합니다. EFA 데이터 저장을 클릭하여 플롯을 저장한 다음 완료를 클릭합니다. EFA 창을 닫습니다.참고: 두 번째 유효성 검사는 각 구성 요소 범위 옆에 있는 확인란을 차례로 클릭하는 것입니다. 이는 각 구성 요소에 긍정적인 농도 제약 조건을 제공하고 이러한 요소가 데이터 집합에 크게 영향을 미치는지 확인합니다. 농도 플롯에서 변경이 나타나지 않으면 데이터가 유효합니다. RAW 창으로 돌아가면 제어판의 프로파일 탭을 클릭하여 곡선을 보고 제어판의 조작 탭에서 곡선을 더 조작하거나 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 메뉴 팝업에서 선택한 파일(들)을 선택하여 *.dat 파일로 곡선을 저장합니다. 파일을 저장합니다. 추가 분석을 위해 분산 IV를 사용합니다.참고: 감출 및 EFA BioXTAS RAW에 대한 추가 정보와 지침은 https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/ 4. SAXS 속성 결정 참고: SAXS 결정에 대한 심층 자습서는 Bioisis.net 있습니다. 여기서는 분산에서 가장 유용한 단추를 강조 표시하여 단계별 기본 단계를 보여 드립니다. 분산 분석 탭에서 수동 Guinier 분석 도구의 G 버튼을 각 샘플 파일의 오른쪽에 누릅니다. 열리는 플롯은 상단 상자의ln[I(q)] 대 q2및 하단 상자의 해당 잔류를 표시합니다. 잔류물 “미소” 또는 “찡그린” 기능이 없는 지점을 추가하거나 제거합니다. Guinier 적합에서 선택한 데이터는 최대 q x Rg 제한 1.3을 초과해서는 안 됩니다. 정규화 된 Kratky 버튼을 누릅니다. 팝업 플롯은 질량 및 농도를 위해 정규화된 거대 분자의 구조 상태에 대한 반정적 평가를 제공합니다.참고: 십자선은 (√3, 1.1)19에서기니에-크라키 지점을 지정합니다. 컴팩트하고 구형 단백질은 Guinier-Kratky 지점에서 최대 값으로 단일 피크를 보여줍니다. 본질적으로 무질서하거나 원통형 생물 중합체는 십자선보다 최대가 크고 감소하지 않을 것입니다. 접힌 도메인과 긴 길쭉한 비정형 영역을 모두 가진 단백질은 십자선을 통해 증가된 최대로 나타날 수 있지만 또한 더 높은 q x Rg에서 명백한 감소 추세를 보여줄 것입니다. 두 플롯, 총 산란 강도 및 q의 함수로서 총 산란 강도의 통합 영역을 가져오는 Vc 버튼(상관관계 볼륨)을 클릭합니다. 플롯은 산란 곡선의 품질을 검증하기 위해 빠른 참조로 사용됩니다.참고: 총 산란 강도는 I(0)에 민감하며 올바르게 측정되지 않으면 플롯에 연속 선이 표시되지 않습니다. 통합 영역 플롯은 이상적으로 각 SAXS 곡선에 대해 확장 된 고원이있는 시그모이드 라인을 보여줘야합니다. 버퍼 불일치/뺄셈이 있는 경우, 샘플에서 집계 또는 파티클 간섭이 더 높은 q-값에서 관찰됩니다. 유연성 버튼을 눌러 유연성 분석을 시작합니다. 이렇게 하면 패널 4개와 하단에 슬라이더가 있는 창이 열립니다. 각 열린 패널은 컴팩트하고 길어지고 유연한 바이오폴리머(23)사이에 존재하는 전력법 관계를 활용하는 플롯을 보여줍니다. 사용하려면 왼쪽 마우스 버튼을 누르면 상자 하단의 슬라이더를 오른쪽에서 왼쪽으로 이동합니다. 플롯 중 하나에 있는 고원에 도달할 때까지 왼쪽으로 천천히 움직입니다.참고: 포로드-데비 플롯에서 고원이 보이는 경우, 샘플은 자연이 작아지며, 이는 정규화된 크라키 플롯의 기니에-크라키 지점에서 하나의 피크와 일치해야 합니다. 고원에 크라키-데비 플롯에서 먼저 도달하면 샘플은 길거나 유연할 가능성이 높습니다. SIBYLS 플롯이 먼저 고원에 있는 경우 샘플에는 압축성과 유연성, 혼합 상태의 파티클이 모두 포함되어 있습니다. 포로 드디비 법과 이러한 유연성 관계에 대한 이론은 람보에서 절묘하게 해결된다, 외23 볼륨을 클릭합니다. 볼륨 측정은 위에서 유연성 분석 후 즉시 수행해야 합니다. 유연성 분석 후 열리면 세 개의 그래프가 있는 팝업이 생성됩니다. 왼쪽 코너에서 포로드-디비 플롯은 슬라이더를 유연성 플롯에서 벗어나 고원 지역을 보여주는 위치를 기억합니다. 파티클의 볼륨을 계산하려면 플롯의 파란색 선이 고원 영역에 맞게 되도록 화살표 단추 또는 상자의 유형을 사용하여 시작 점과 끝점을 이동합니다. 편견없는 결과를 위해, 오른쪽 상단 의 잔류 는 Porod-Debye 지수 파워 법 적합, 패턴을 표시하지 않아야합니다. P(r) 탭을 누릅니다. 실제 공간 분포는 왼쪽 패널과 오른쪽 패널의 샘플에 대한 산란 곡선에 있습니다. 목표는 상호 공간 SAXS 곡선에서 샘플의 실제 공간 표현을 만드는 것입니다. 이상적으로, 분포 곡선은 파도가 없는 것처럼 매끄럽고 X축에 부드럽게 키스해야 합니다.참고: 장비의 측정된 q-range는 버퍼 매칭, 응집, 방사선 손상, 최적 노출 시간 및 낮은 입자 농도로 인해 완전히 사용할 수 없습니다. P(r)결정 단계는 SAXS 데이터 집합의 사용 가능한 Q분 및 q최대 범위를 근본적으로 결정하며 후속 모델링 또는 피팅에 사용되는 이 데이터 범위여야 합니다. 샘플 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 DMAX 찾기를 클릭하여 새 창을 엽니다. dmax에 대한 제한은 제안된 qmax(사용된 최대 데이터 포인트), 하부 및 상부 D최대 제한 및 낮은 알파 점수와 함께 미리 설정됩니다. 세 가지 모델(L1-norm, Legendre 및 Moore)을 선택할 수 있으며 배경 사용이 포함되어 있습니다. 첫 번째 인스턴스에서 변경되지 않은 상태로 둡니다. 시작 버튼을 누릅니다. 복합 분포는 제안된 dmax 및 알파 레벨 아래에 작성된 왼쪽 패널에서 만들어집니다. 이 허용 되는 경우 다음 창을 닫고 P (r) 탭으로 돌아갑니다. 상호 공간 플롯은 제안된 qmax와일치하도록 잘라졌습니다. 모델 무어를선택하고 배경을 클릭한 다음 알파 레벨과최대값을 팝업 상자에서 제안된 값으로 설정합니다. 구체화 버튼을 누릅니다. 교차 유효성 검사 플롯이 빨간색으로 표시된 점을 거부해야 하는지 보여 줄 것입니다. 몇 점만 거부되고 분포가 양호해 보이는 경우 모델이 좋습니다.참고: 교차 유효성 검사 플롯은 결정된 P(r) 분포와 일치하지 않는 데이터의 영역을 강조 표시합니다. 거부된 지역이 주로 y축 근처의 저q 영역에 있는 경우, 이는 집계 또는 더 높은 순서의 올리고머가 너무 짧은 D최대를 시사합니다. 상위 및 낮은 해상도 정보 간의 불일치를 강조합니다. 여기서는 설명서, 시행착오 접근 방식을 사용하여 d최대 및 q분(시작 값 증가)을 조정해야 합니다. 마찬가지로, 거부된 영역이 주로 높은 q 영역에 있는 경우, 이는 배경 빼기에 문제가 있거나 신호가 너무 약하여 결정된 P(r)-분포에 의해 의미 있게 설명될 수 없다는 것을 나타낼 수 있다. 이 경우 추가 데이터가 거부되지 않을 때까지 qmax를 잘린(끝 감소)해야 합니다. 이상적으로 거부된 포인트는 무작위로 분산되어야 하며 사용 가능한 데이터의 5% 미만을 구성해야 합니다. 제대로 정의된 qmin,q max 및 “dmax”는 dmax가 X축에 키스하는 매끄러운 분포를 생성합니다. 그러나 이 값을 너무 늘려 기니에 영역을 완전히 제거하지 마십시오. 이 점은 q x l(q) 상자(테이블 위의 패널 왼쪽)를 확인하여 쉽게 찾을 수 있습니다. 산란 곡선은 최대 변곡점이 Guinier 영역의 일부이기 전에 이 곡선의 모든 지점에서 “총 산란 강도 플롯”으로 대체됩니다. 포인트를 제거한 후 다시 시도하여 “dmax”를늘여서 감소시키고 다시 한 번 구체화합니다. 특히 유효성 검사 곡선시작부터 많은 점이 거부되는 경우 데이터가 구조 모델링에 적합하지 않음을 강력하게 시사합니다. 보고서를 인쇄하려면 분석 탭으로 다시 이동하여 샘플을 강조 표시한 다음 샘플 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 메뉴의 단일 데이터 집합에서 보고서 만들기로 이동합니다. 주석을 추가할 수 있도록 텍스트 상자가 열립니다. 생성된 모든 수치와 값을 보여주는 PDF 문서가 생성됩니다.