Analisi dei dati SEC-SAXS tramite deconvoluzione EFA e Scatter

1. L’espressione proteica, la purificazione e la misurazione SEC-SAXS si basano sul protocollon. 13 pubblicato Segui in breve il protocollo di raccolta dati SEC-SAXS in linea (Brennich et al.6). Equilibrare la colonna SEC con almeno 2 volumi di colonna di buffer di esecuzione SEC (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl). Preparare 50 μL di campione di E9 exomeno a 8\u201210 mg/mL con un eccesso molare del 20% di dsDNA parziale (TCAGGAAGATAACAGCGGTTTAGCC e GGCTAAACCGCTGTTATCTT). E9 exominus si lega ad un KD di 12 ± 6 nM (vedi Dati supplementari). Iniettare 50 μL di questa miscela su una colonna SEC (S200 Increase) in linea con la cella di flusso per le misurazioni SAXS a 0,3 mL/min. Raccogli 1000 fotogrammi a 1 s di esposizione ciascuno.NOTA: Sulla linea di fascio BioSAXS BM29, presso l’European Synchrotron Facility (ESRF) i singoli telai vengono elaborati automaticamente e indipendentemente all’interno del framework EDNA14. Dopo la raccolta dei dati, aprire il database ISPyB20 e nella scheda Acquisizione dati premere il pulsante Vai per accedere al set di dati e i risultati dell’analisi automatica21. Scarica i dati. 2. Analisi dei dati primari Aprire il programma basato su Java Dispersione IV (vedere la Tavola dei materiali) ed eseguire una sottrazione di fondo per i dati sec (Size Exclusion Chromatography).Aprire la scheda SEC. Trascinare i file di dati ridotti (*.dat) nella finestra “Rilascia dati sotto”. Impostare la directory di output “Out Dir ::” facendo clic sul pulsante Dir output con etichetta blu.NOTA: se i dati sono stati raccolti in nm-1, sarà necessario selezionare una casella di conversione (in basso a sinistra del pannello) quando si rilasciano file nella finestra o nella scheda di sottrazione. Modificare i dettagli sperimentali, utilizzare il pulsante Modifica dettagli e compilare il maggior numero possibile di campi, tra cui sezioni su cui è stata utilizzata la linea di origine/trave per raccogliere dati, i parametri di raccolta e i dettagli di esempio. Questi verranno salvati con i dati e permetteranno di popolare più facilmente la sezione “Parametri di raccolta dati” nelle pubblicazioni future. Immettere il nome dell’esempio nella casella Salva con nome. Fare clic su TRACE.NOTA: Questo ha due effetti. In primo luogo, creerà un file *.sec per i dati. Questo è un singolo file di testo che raccoglierà tutte le osservazioni sperimentali dai file *.dat separati. Inoltre, il file *.sec contiene il set medio di frame che è lo sfondo del buffer, tutti i frame utilizzati nella media e i frame sottratti sullo sfondo del buffer nell’intero esperimento SEC-SAXS. In secondo luogo, viene creato un plottaggio del segnale che traccia il numero di fotogramma rispetto al rapporto integrale con lo sfondo. In questo modo vengono mostrati i fotogrammi selezionati (grigi) che sono stati calcolati in media per la sottrazione del buffer. I punti per il buffer medio vengono determinati dall’intero intervallo di dati. Tuttavia, è consigliabile scegliere manualmente i frame tampone per la media in quanto può verificarsi uno sfondo mal definito a causa di colonne scarsamente equilibrate o sporche o incrostazioni capillari22. Selezionare manualmente i frame del buffer. Fate clic su Cancella buffer (Clear Buffers), quindi riselezionate un’area buffer con un clic sinistro trascinato sulla curva di traccia. Idealmente, questa dovrebbe essere una regione piatta prima del volume vuoto della colonna SEC di circa 100 fotogrammi. Fare clic su SET BUFFER, quindi su Aggiorna per ricalcolare il file *.sec che potrebbe richiedere alcuni minuti. Identificare una regione di interesse (ROI). Nel plottaggio del segnale, selezionare la regione del picco di interesse, con un clic sinistro.NOTA: questo popola tre grafici nel pannello di destra. I primi due grafici sono collegati con il mirino che si muove tra di loro, un secondo grafico del segnale (in alto a destra) mostra solo il ROI selezionato, con l’intensità di ogni fotogramma in blu e il corrispondente Rg di ogni fotogramma in rosso e una corrispondente mappa termica sottostante, mostrando i residui per ogni fotogramma colorato secondo l’analisi di autocorrelazione Durbin-Watson. Le regioni ad alta somiglianza sono ciano colorato (Durbin-Watson, d = 2) mentre le cornici dissimili seguiranno il blu più scuro ai rosa e infine ai rossi a seconda della gravità della dissimilarità (d > 2). Il grafico inferiore è una curva I contro q sottratta per il fotogramma centrale selezionato (indicato anche da una linea verticale). I tasti di direzione possono essere utilizzati per navigare tra i fotogrammi sottratti. Il plottaggio I contro q dimostrerà la qualità dei fotogrammi sottratti dall’esperimento SEC. Selezionate i fotogrammi da unire. Fate clic sul mirino nel plottaggio della mappa termica per selezionare il sottoinsieme di fotogrammi che verranno utilizzati per l’unione. Il mirino identificherà un’area triangolare di cian prevalentemente che cade sul lato in basso a destra del mirino. Utilizzate un clic del mouse per impostare questi fotogrammi come selezionati ed evidenziare i fotogrammi nell’area corrispondente del plottaggio segnale sopra. Questi fotogrammi dovrebbero idealmente evidenziare una regione con un Rg stabile.NOTA: se necessario, ingrandisci la mappa termica con un trascinamento con un clic sinistro del mouse e rimpipidisci con un clic sinistro a destra. Se soddisfatti dei fotogrammi selezionati, fate clic su UNISCI (MERGE). In questo modo i fotogrammi sottratti verranno uniti e vengono presenti nella scheda ANALISI. 3. Deconvoluzione dei dati Aprire il programma di deconvoluzione (ad esempio, BioXTAS Raw 2.0.0). Nel programma di deconvoluzione caricare il dataset, in Scheda File, nel Pannello di controlloutilizzare il simbolo foldether per individuare i dati o copiare e incollare la posizione nella barra degli indirizzi.NOTA: assicurarsi che la cartella contenga solo i file *.dat non elaborati e nessun file di dati elaborato o medio. Evidenzia tutti i file *.dat, premi il pulsante Serie trama, un grafico di intensità integrata rispetto al numero di fotogramma verrà disegnato nel “Plot di serie”. Nel Pannello di controllo selezionare la scheda Serie e quindi fare clic per evidenziare la curva. Aprire la finestra popup LC Analysis utilizzando il pulsante alla base del pannello di controllo. Questa finestra dà accesso a diverse opzioni, come la selezione di diversi tipi di molecole (proteine o RNA). Consente inoltre all’utente di selezionare l’area buffer per il plottaggio. In prima istanza fare clic su Auto; questa dovrebbe selezionare un’area buffer adatta.NOTA: se questo non riesce, probabilmente a causa di una linea di base instabile, “Aggiungi area” per ottimizzare l’area del buffer. In questo modo la casella Buffer viene popolata con una casella più piccola in cui è possibile aggiungere manualmente i numeri di fotogramma da utilizzare per il buffer. In alternativa, fate clic su “Scegli” per dare la possibilità di selezionare un’area nel plottaggio. Individuare l’area, fare clic con il pulsante sinistro del mouse una volta per la posizione iniziale, spostare il cursore nella posizione successiva e fare di nuovo clic con il pulsante sinistro del mouse. Potrebbe essere necessario aggiungere più di una posizione buffer. Fate clic su Imposta buffer (Set buffer) e le curve verranno sottratte e il Rg calcolato attraverso il picco SEC. Se viene visualizzata una casella popup, fare clic su OK. Per avviare l’Evolving Factor Analysis (EFA), fare clic con il pulsante destro del mouse sul file evidenziato nella parte inferiore Pannello di controllo quindi selezionare Efa dal menu.Verificare che si apra una finestra popup che mostri la scomposizione del singolo valore (SVD) del set di dati. Nella casella controlli, selezionare la casella Usa fotogrammi in modo che l’intera area di picco da deconvolutare sia coperta nel tracciato di intensità. Il grafico “Valori singolari”, in alto a destra, mostra l’intensità dei valori singolari (picchi/specie separate) sopra la linea di base.NOTA: Il numero di punti presenti al di sopra della linea di base rappresenta il numero di specie di dispersione presenti. Con l’avvertenza che è la grandezza relativa del valore singolare per l’area piatta / linea di base che conta. Per convalidare il numero di singoli valori, utilizzate il plottaggio di correzione automatica inferiore. Questo mostra i vettori di correlazione singola destra e sinistra. Fare clic su Avanti.NOTA: Questi rappresentano essenzialmente profili di dispersione o concentrazione per il vettore nella soluzione. Dove la dimensione assoluta rappresenta il significato del vettore. Un componente significativo avrà una correzione automatica vicino a 1 (una regola di taglio del pollice è >0,6\u20120.7). RAW calcola volontariamente questo ed è mostrato nella casella #Significant SUV, in basso a sinistra, anche se è possibile modificarlo se necessario. Se ci sono più valori singoli (ad esempio 4+), potrebbe essere necessario esaminare solo 2 o 3 dei soli componenti, alterando l’intervallo dei dati utilizzati. Quanto più basso è il numero di componenti, tanto più facile sarà l’analisi dell’EFA, ma a costo di utilizzare meno dati. In situazioni complesse, dove i vettori singolari sinistro e destro, che dovrebbero essere simili, non corrispondono a ridurre il numero significativo di SV e diminuire il numero di fotogrammi usati fino a quando i vettori singolari sinistro e destro sono simili. Controllare che l’EFA sia calcolato generando grafici nelle direzioni avanti e indietro per ogni vettore. Questi grafici mostrano quando i componenti iniziano (plottaggio in avanti) e escono (plottaggio all’indietro) il profilo della soluzione per i dati SEC-SAXS selezionati. RAW cerca di identificare questi intervalli; cambiarli usando le frecce accanto ai contatori in modo che ogni cerchio sia all’inizio di un punto di flessione che sale da o scende alla linea di base. Fare clic su Avanti.NOTA: L’ultimo stadio dell’EFA riporta i vettori SVD in curve di dispersione. A sinistra della finestra, gli intervalli definiti in precedenza vengono tracciati nella parte superiore. Questi intervalli sono i vincoli per definire dove ruotare di nuovo i vettori singolari in curve di dispersione. Il pannello di destra mostra questi corrispondenti profili di curva di dispersione, per ogni picco separato. Un appezzamento per la concentrazione di ogni picco, che dovrebbe essere rappresentativo dei profili di eluizione e un grafico per l’errore medio ponderato chi2. Il grafico chi2 sta misurando i dati di deconvoluzione impostati sul set di dati originale. Idealmente, questo sarà piatto, tuttavia i picchi possono spesso essere visti. Provare a ridurre o eliminare i picchi modificando i controlli intervallo dicomponenti , identificare prima approssimativamente quale fotogramma corrisponde al picco (dal tracciato chi2) e quindi, nei controlli intervallo, quale componente contiene questo fotogramma (potrebbe essere più di uno), utilizzando le frecce, spostarsi verso l’alto o verso il basso nell’intervallo corrispondente.NOTA: Questo dovrebbe produrre una risposta, aumentando o diminuendo il picco. Se il frame spike era presente in più di un componente, potrebbe essere necessaria una piccola prova ed errore tra ogni componente. Una volta raggiunto un minimo di chi2, eseguire un controllo di convalida facendo clic indietro, la finestra precedente sembra consentire di verificare se le modifiche apportate hanno modificato drasticamente i grafici EFA originali. Se sembrano ancora validi, fare clic su Avanti. Fate clic su Salva dati EFA (Save EFA Data) per salvare i tracciati, quindi selezionate Fatto (Done). per chiudere la finestra EFA.NOTA: una seconda convalida è fare clic sulla casella di controllo accanto a ciascun intervallo di componenti, a sua volta. Questi forniscono un vincolo di concentrazione positivo per ogni componente e la disattivazione controllerà se questi influenzano significativamente il set di dati. Se non si vede alcuna modifica nel grafico di concentrazione, i dati sono validi. Di nuovo nella finestra RAW, fate clic sulla scheda Profili nel Pannello di controllo per visualizzare le curve e nella scheda Manipolazione del Pannello di controllo, manipolate ulteriormente le curve o salvate le curve come file *.dat facendo clic con il pulsante destro del mouse sul file e selezionando salva file selezionati dal menu. Salvare il file. Utilizzare Scatter IV per ulteriori analisi.NOTA: Ulteriori informazioni e istruzioni sulla deconvoluzione e su EFA BioXTAS RAW sono disponibili all’https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/ 4. Determinare le proprietà SAXS NOTA: Un tutorial approfondito per la determinazione saxs si trova a Bioisis.net. Qui mostriamo un approccio passo dopo passo di base, evidenziando i pulsanti più utili in Scatter. Nella scheda Analisi dispersione premere il tasto G per lo strumento manuale di analisi Guinier, a destra di ogni file di esempio. Il grafico che si apre mostra ln[I(q)] rispetto a q2 nella casella superiore e i residui corrispondenti nella casella inferiore. Aggiungere o rimuovere punti in modo che i residui non abbiano una funzione “sorriso” o “cipiglio”. I dati selezionati nella vestibilità Guinier non devono superare il limite massimo q x Rg di 1,3. Premere il pulsante Kratky normalizzato; la trama che si apre fornisce una valutazione semi-quantitativa dello stato strutturale della macromolecola, normalizzata per massa e concentrazione.NOTA: I mirini designano il punto di Guinier-Kratky a (√3, 1.1)19. Una proteina sferica compatta mostrerà un singolo picco con il valore massimo nel punto di Guinier-Kratky. Un biopolimero intrinsecamente disordinato o cilindrico avrebbe un massimo maggiore del mirino e non diminuirebbe. Una proteina che avesse sia domini piegati che lunghe regioni non strutturate allungate potrebbe presentare un aumento massimo attraverso il mirino, ma mostrerebbe anche un’ovvia tendenza al ribasso a q x Rg più alto. Fare clic sul tasto Vc (Volume di correlazione), che riporta due grafici, l’intensità totale diffusa e un’area integrata dell’intensità totale diffusa in funzione di q. I grafici vengono utilizzati come riferimento rapido per convalidare la qualità della curva di dispersione.NOTA: L’intensità totale diffusa è sensibile all’I(0) e se questo non è stato misurato correttamente, il grafico non mostrerà una linea continua. La trama dell’area integrata, idealmente, dovrebbe mostrare una linea sigmoidale con un plateau esteso per ogni curva SAXS. Se nel campione sono presente interferenze di non corrispondenza/sottrazione del buffer, aggregazione o interparticella, si osserverà una pendenza nitida a valori q più elevati. Premere il pulsante Flessibilità per avviare l’analisi della flessibilità. Questo aprirà una finestra con quattro pannelli e un cursore nella parte inferiore. Ogni pannello aperto mostra una trama che sfrutta una relazione di legge di potenza che esiste tra biopolimeri compatti e allungati / flessibili23. Per usare, spostare il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore della casella da destra a sinistra con il pulsante sinistro del mouse premuto. Continuare a muoversi lentamente a sinistra fino a raggiungere un altopiano in uno dei appezzamenti.NOTA: Se l’altopiano è visto nella trama di Porod-Debye, allora il campione è di natura compatta, che dovrebbe essere coerente con un singolo picco nel punto di Guinier-Kratky in un appezzamento kratky normalizzato. Se l’altopiano viene raggiunto per primo nella trama di Kratky-Debye, il campione è molto probabilmente allungato o flessibile. Se il plottaggio SIBYLS è il primo a stabilizzarsi, allora il campione molto probabilmente contiene aree di compattezza e flessibilità, una particella con stati misti. La teoria di questo rapporto di flessibilità con la legge porod-debye è squisitamente affrontata in Rambo, etal. Fare clic su Volume. La determinazione del volume deve essere eseguita immediatamente dopo l’analisi della flessibilità dall’alto. Quando viene aperto dopo l’analisi della flessibilità, viene generato un pop-up con altri tre grafici. Nell’angolo in basso, a sinistra, la trama Porod-Debye ricorda dove uno ha lasciato il cursore dalla trama di flessibilità, mostrando l’area plateaued. Per calcolare il volume della particella, spostare l’inizio e i punti finali utilizzando i pulsanti freccia o digitare le caselle, in modo che la linea blu sul tracciato si adatti alla regione plateau. Per un risultato imparziale, i residui nella legge di potenza dell’esponente Porod-Debye in alto a destra, non dovrebbero mostrare alcun modello. Premere la scheda P(r). La distribuzione dello spazio reale si trova nel pannello sinistro e la curva di dispersione per il campione nel pannello di destra. L’obiettivo è quello di creare una rappresentazione dello spazio reale del campione dalla curva SAXS dello spazio reciproco. Idealmente, la curva di distribuzione sarà liscia senza onde presenti e dovrebbe semplicemente baciare delicatamente l’asse x.NOTA: l’intervallo q misurato dello strumento potrebbe non essere del tutto utilizzabile a causa della scarsa corrispondenza del buffer, dell’aggregazione, dei danni da radiazioni, dei tempi di esposizione non ottimali e delle basse concentrazioni di particelle. Il passaggio di determinazione P(r) determinerà fondamentalmente l’intervallo qmin e q max utilizzabile del set di dati SAXS e dovrebbe essere questo intervallo di dati utilizzato per qualsiasi modellazione o raccordo successivo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome dell’esempio, quindi scegliere Trova DMAX per aprire una nuova finestra. I limiti per il dmax sono pre-impostati con il qmax suggerito (punti dati massimi utilizzati), i limiti massimi dinferiori e superiori e un punteggio alfa inferiore e superiore. È possibile scegliere tre modelli (L1-norm, Legendre e Moore) e l’uso dello sfondo incluso. Lasciate questi invariati in prima istanza. Premere il pulsante Start. Una distribuzione composita viene creata nel pannello sinistro con il livello dmax e alfa suggerito scritto sotto. Se questo sembra accettabile, chiudere la finestra e tornare alla scheda P(r). La trama spaziale reciproca sarà stata ritagliata per corrispondere al qmax suggerito. Selezionate il modello Moore, fate clic su Sfondo (Background), quindi impostate il livello alfa e dmax sui valori suggeriti dalla casella popup. Premere il pulsante di affinare. Verrà visualizzato un grafico di convalida incrociata che mostra se alcuni punti devono essere rifiutati, contrassegnati in rosso. Se ci sono solo pochi punti rifiutati e la distribuzione sembra buona, il modello è buono.NOTA: il grafico di convalida incrociata evidenzierà le aree dei dati che non sono coerenti con la distribuzione P(r) determinata. Se la regione respinta si trova principalmente nella regione low-q, cioè nella regione vicino all’asse y, ciò suggerisce probabilmente un d max troppobreve, presenza di aggregazione o oligomeri di ordine superiore. Evidenzia un’incoerenza tra le informazioni a risoluzione più alta e inferiore. Qui, dmax e qmin (aumentando il valore iniziale) dovrebbero essere regolati utilizzando un approccio manuale di prova ed errore. Allo stesso modo, se la regione respinta si trova principalmente nella regione high-q, questo può indicare un problema con la sottrazione di fondo o che il segnale è troppo debole per essere spiegato in modo significativo dalla determinata distribuzione P(r). In questo caso, qmax deve essere troncato (fine decrescente) fino a quando non vengono rifiutati dati aggiuntivi. Idealmente, i punti rifiutati dovrebbero essere distribuiti casualmente e covare meno del 5% dei dati utilizzabili. Un qmin, q maxe “dmax” correttamente definitoprodurrà una distribuzione fluida in cui il dmax bacia l’asse x. Tuttavia, non aumentare questo valore così tanto che rimuove completamente la regione di Guinier. Questo punto si trova facilmente selezionando la casella q x l(q) (a sinistra del pannello sopra la tabella). La curva di dispersione è sostituita dal “plot Intensità totale sparsa”, su questa curva tutti i punti prima dell’inflessione massima fanno parte della regione di Guinier. Dopo aver rimosso i punti, riprovare ad aumentare/diminuire la “dmax”e quindi perfezionare ancora una volta. Se i problemi persistono, specialmente quando molti punti vengono rifiutati dall’inizio della curva di convalida, ciò suggerisce fortemente che i dati non sono ideali per la modellazione strutturale. Per stampare un report, tornare alla scheda Analisi, fare clic con il pulsante sinistro del mouse per evidenziare l’esempio, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome dell’esempio e passare a Crea report da un singolo set di dati nel menu. Verrà visualizzata una casella di testo per consentire l’aggiunta di commenti. Viene prodotto un documento PDF che mostra tutte le cifre e i valori generati.