Проточная цитометрическая характеристика развития В-клеток мышей

Моноклональные антитела все чаще становятся предпочтительной терапией для многих заболеваний человека, поскольку они становятся частью основной ^{медицины1,2}. Ранее мы описали генетически модифицированных мышей, которые эффективно вырабатывают антитела, скрывающие полностью переменные области человека с константами IgH ^мыши3,4. Совсем недавно мы описали генетически модифицированных мышей, которые продуцируют антителоподобные молекулы, которые имеют отчетливое связывание ^{антигенов5}. Антитела секретируются В-клетками и составляют основу адаптивного гуморального иммунитета. Существует два различных типа В-клеток, B-1 и B-2. У млекопитающих клетки B-1 возникают в печени плода и обогащаются тканями слизистой оболочки и плевральной и брюшной полостями после рождения, в то время как клетки B-2 возникают в печени плода до рождения, а затем в костном мозге (БМ). Клетки B-2 обогащаются вторичными лимфоидными органами, включая селезенку и ^{кровь6,7,8}. В БМ гемопоэтические предшественники B-2 начинают дифференцироваться в про-В-клетки после инициирования перестройки тяжелой цепи Ig ^mu9,10. Успешная перестройка тяжелой цепи Ig и ее сборка в пре-В-клеточный рецептор (пре-BCR), наряду с сигнальной и пролиферативной экспансией, приводит к дифференцировке в пре-В-клетки. После того, как пре-В-клетки перестраивают свои легкие цепи Ig kappa (Igκ) или, если это непродуктивно, легкие цепи Ig lambda (Igλ), они соединяются с μ тяжелой цепи, что приводит к поверхностной экспрессии IgM BCR. Важно отметить, что поверхностная экспрессия IgM, как известно, снижается в условиях аутореактивности, что способствует самотолерантности в функционально невосприимчивых или анергических В-клетках11,12. Незрелые В-клетки затем вступают в переходную стадию, где они начинают совместно экспрессировать IgD и мигрируют из БМ в селезенку. В селезенке экспрессия IgD еще больше увеличивается, и клетки созревают во вторую стадию переходных В-клеток, за которой следует завершение их статуса созревания и развитие либо в клетки маргинальной зоны (MZ), либо в фолликулярные (Fol) клетки13,14,15. У взрослых мышей, в неболеющих условиях, количество зрелых В-клеток остается постоянным, несмотря на то, что ежедневно в БМ генерируется 10-20 миллионов незрелых В-клеток. Из них только три процента попадают в пул зрелых В-клеток. Размер периферического В-клеточного компартмента ограничен гибелью клеток, отчасти из-за нескольких факторов, включая самореактивность и неполное созревание16,17,18. Проточный цитометрический анализ широко использовался для характеристики и перечисления многих субкомпонентов иммунных клеток у людей и мышей. Хотя существует некоторое сходство между человеческими и мышиными В-клеточными компартментами, этот протокол применяется только к анализу мышиных В-клеток. Этот протокол был разработан с целью фенотипирования генетически модифицированных мышей, чтобы определить, изменят ли генетические манипуляции развитие В-клеток. Проточная цитометрия также была чрезвычайно популярна во многих дополнительных приложениях, в том числе при измерении активации клеток, функции, пролиферации, анализа циклов, анализа содержания ДНК, апоптоза и сортировки клеток ^19,20.

Проточная цитометрия является предпочтительным инструментом для характеристики различных лимфоцитарных компартментов у мышей и людей, в том числе в сложных органах, таких как селезенка, БМ и кровь. Благодаря широко доступным мышино-специфическим реагентам антител для проточной цитометрии, этот метод может быть использован для исследования не только белков клеточной поверхности, но и внутриклеточных фосфопротеинов и цитокинов, а также функциональных ^{показаний21}. Здесь мы демонстрируем, как реагенты проточной цитометрии могут быть использованы для идентификации подмножеств В-клеток по мере их созревания и дифференцировки во вторичных лимфоидных органах. После оптимизации условий окрашивания, обработки образцов, правильной настройки прибора и сбора данных и, наконец, анализа данных можно использовать протокол комплексного проточного цитометрического анализа компартмента В-клеток у мышей. Такой комплексный анализ основан на десятилетней номенклатуре, разработанной Харди и его коллегами, где развивающиеся клетки BM B-2 могут быть разделены на различные фракции (Fraction) в зависимости от их экспрессии B220, CD43, BP-1, CD24, IgM и ^IgD22. Hardy et al., показали, что B220⁺ CD43 BM B-клетки могут быть подразделены на четыре подмножества (фракция A-C’) на основе экспрессии BP-1 и CD24 (30F1), в то время как B220⁺ CD43^{-(тусклые до отрицательных) BM B-клетки} могут быть разрешены на три подмножества (фракция D-F) на основе дифференциальной экспрессии IgD и поверхностного ^IgM23. Фракция A (пре-про-В клетки) определяется как BP-1-CD24 (30F1)^–, фракция B (ранние про-В-клетки) определяется как BP-1-CD24 (30F1)⁺, фракция C (поздние про-В-клетки) определяется как BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺, а фракция C’ (ранние клетки пре-В) определяется как BP-1⁺ и CD24high. Кроме того, фракция D (пре-В-клетки) определяется как B220⁺ CD43-IgM-В-клетки, а фракция E (вновь генерируемые В-клетки, комбинация незрелых и переходных) определяется как B220⁺ CD43-IgM^{+ В-клетки}, а фракция F (зрелые, рециркулирующие В-клетки) определяется как B220-высокие CD43-IgM⁺ В-клетки. Напротив, большинство наивных В-клеток, обнаруженных в селезенке, можно разделить на зрелые (B220 ⁺ CD93^{-) В-клетки} и переходные (T1, T2, T3) клетки в зависимости от экспрессии CD93, CD23 и IgM. Зрелые В-клетки могут быть разрешены на маргинальные зоны и фолликулярные подмножества на основе экспрессии IgM и CD21/CD35, а фолликулярные подмножества могут быть дополнительно разделены на зрелые фолликулярные подмножества клеток типа I и фолликулярные подмножества В-клеток типа II в зависимости от уровня их поверхностной экспрессии IgM и ^IgD24. Эти селезеночные популяции В-клеток экспрессируют преимущественно Igκ легкую цепь. Наконец, популяции В-клеток B-1, которые происходят из печени плода и в основном находятся в брюшной и плевральной полостях взрослых мышей, были описаны в литературе. Эти перитонеальные В-клетки можно отличить от ранее описанных В-2 В-клеток по отсутствию экспрессии CD23. Затем они далее подразделяются на популяции B-1a или B-1b, причем первые определяются присутствием CD5, а вторые – его ^{отсутствием25}. Предшественники клеток B-1 в изобилии присутствуют в печени плода, но не обнаруживаются во взрослом БМ. Хотя клетки B-1a и B-1b происходят от разных предшественников, они оба засеивают брюшную и плевральную ^{полости24}. В отличие от клеток B-2, клетки B-1 уникально способны к самообновлению и отвечают за выработку естественных антител IgM.

Дефекты в развитии В-клеток могут возникать во многих случаях, включая недостатки в компонентах ^BCR26,27, возмущения сигнальных молекул, которые влияют на силу передачи сигналов BCR14,28,29, или нарушение цитокинов, которые модулируют выживание В-клеток30,31 . Анализ проточной цитометрии лимфоидных компартментов способствовал характеристике блоков развития В-клеток у этих мышей и многих других. Одним из преимуществ проточного цитометрического анализа лимфоидных компартментов является то, что он предлагает возможность проводить измерения на отдельных клетках, полученных из живой диссоциированной ткани. Наличие реагентов в постоянно расширяющемся диапазоне флуорофоров позволяет проводить одновременный анализ нескольких параметров и позволяет оценивать гетерогенность В-клеток. Кроме того, перечисление В-клеток методом проточного цитометрического анализа дополняет другие иммунологические анализы, такие как методы иммуногистохимии, которые визуализируют локализацию клеток в лимфоидных органах, обнаружение уровней циркулирующих антител в качестве меры гуморального иммунитета, а также две фотонные микроскопии для измерения реакций В-клеток в реальном пространстве и ^{времени32}.