Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Os anticorpos monoclonais têm se tornado cada vez mais a terapia de escolha para muitas doenças humanas à medida que se tornam parte da medicina ^{convencional1,2}. Descrevemos anteriormente camundongos geneticamente modificados que produzem anticorpos de forma eficiente abrigando regiões variáveis totalmente humanas com constantes de IgH de ^{camundongos3,4}. Mais recentemente, descrevemos camundongos geneticamente modificados que produzem moléculas semelhantes a anticorpos que têm antígeno-vinculativos ^distintos5. Anticorpos são secretados por células B e formam a base da imunidade humorativa adaptativa. Existem dois tipos distintos de células B, B-1 e B-2. Em mamíferos, as células B-1 originam-se no fígado fetal e são enriquecidas em tecidos mucosas e nas cavidades pleural e peritoneal após o nascimento, enquanto as células B-2 se originam no fígado fetal antes do nascimento e posteriormente na medula óssea (MMO). As células B-2 são enriquecidas em órgãos linfoides secundários, incluindo o baço e o sangue ^6,7,8. No BM, progenitores hematopoiéticos B-2 começam a se diferenciar para células pró-B após o início do rearranjo da cadeia pesada Ig ^mu9,10. O rearranjo bem sucedido da cadeia pesada de Ig e sua montagem no receptor de células pré-B (pré-BCR), juntamente com sinalização e expansão proliferativa, leva à diferenciação das células pré-B. Depois que as células pré-B reorganizam suas cadeias leves Ig kappa (Igκ), ou se improdutivas, Ig lambda (Igλ), elas combinam com μ corrente pesada, resultando na expressão IgM BCR superficial. É importante ressaltar que a expressão superficial IgM é conhecida por ser reduzida em condições de autoreatividade, contribuindo assim para a auto tolerância em células B funcionalmente não respondidas ou ^{argicasas11,12}. As células B imaturas então entram em um estágio de transição, onde começam a co-expressar IgD e migram do BM para o baço. No baço, a expressão igD aumenta ainda mais e as células amadurecem em um segundo estágio de células B transitórias, seguidas pela conclusão de seu status de maturação e desenvolvimento em células de zona marginal (MZ) ou folicular (Fol)13,14,15. Em camundongos adultos, em um ambiente não doente, o número de células B maduras permanece constante, apesar de 10-20 milhões de células B imaturas serem geradas diariamente no BM. Destes, apenas 3% entram no pool de células B maduras. O tamanho do compartimento celular B periférico é limitado pela morte celular, devido em parte a vários fatores, incluindo auto-reatividade e maturação incompleta16,17,18. A análise citométrica de fluxo tem sido amplamente usada para caracterizar e enumerar muitos subcompartimentais de células imunes em humanos e camundongos. Embora existam algumas semelhanças entre compartimentos de células B humanas e murinas, este protocolo se aplica apenas à análise de células murinas B. Este protocolo foi desenvolvido com o propósito de fenotipar camundongos geneticamente modificados, para determinar se a manipulação genética alteraria o desenvolvimento de células B. A citometria de fluxo também tem sido extremamente popular em muitas aplicações adicionais, incluindo na medição da ativação celular, função, proliferação, análise de ciclo, análise de conteúdo de DNA, apoptose e classificação celular ^19,20.

A citometria de fluxo é a ferramenta escolhida para caracterizar vários compartimentos de linfócitos em camundongos e humanos, inclusive em órgãos complexos como o baço, BM e sangue. Devido a reagentes de anticorpos específicos do rato amplamente disponíveis para citometria de fluxo, esta técnica pode ser usada para investigar não apenas proteínas da superfície celular, mas também fosfoproteínas intracelulares e citocinas, bem como leituras ^funcionais21. Aqui demonstramos como reagentes de citometria de fluxo podem ser usados para identificar subconjuntos de células B à medida que amadurecem e diferenciam em órgãos linfoides secundários. Após a otimização das condições de coloração, manuseio de amostras, configuração correta do instrumento e aquisição de dados e, finalmente, análise de dados, um protocolo para análise citométrica de fluxo abrangente do compartimento celular B em camundongos pode ser utilizado. Tal análise abrangente baseia-se em uma nomenclatura de décadas concebida por Hardy e colegas, onde o desenvolvimento de células BM B-2 pode ser dividido em diferentes frações (Fração) dependendo de sua expressão de B220, CD43, BP-1, CD24, IgM e ^IgD22. Hardy et al., mostraram que as células B220⁺ CD43 BM B podem ser subdivididas em quatro subconjuntos (Fração A-C’) com base na expressão BP-1 e CD24 (30F1), enquanto as células B220⁺ CD43^{-(dim to neg)} BM B podem ser resolvidas em três subconjuntos (Fração D-F) com base na expressão diferencial de IgD e IgM23 de superfície. A fração A (células pré-pró-B) são definidas como BP-1^– CD24 (30F1)^–, A fração B (células pro-B precoces) são definidas como BP-1^– CD24 (30F1)⁺, Fração C (células pro-B tardias) são definidas como BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺, e Fração C’ (células pré-B precoces) são definidas como BP-1⁺ e CD24nenta. Além disso, as células Fração D (pré-B) são definidas como células B220⁺ CD43-IgM-B e Fração E (células B recém-geradas, combinação de imaturo e transitório) são definidas como células B220⁺ CD43^– IgM⁺ B e Fraction F (células B maduras e recircuturas) são definidas como células B220high CD43^– IgM⁺ B. Em contraste, a maioria das células B ingênuas encontradas no baço pode ser dividida em células B maduras (B220⁺ CD93^–) e células transitórias (T1, T2, T3) dependendo da expressão de CÉLULAS CD93, CD23 e IgM. Células B maduras podem ser resolvidas em subconjuntos marginais e foliculares baseados na expressão de IgM e CD21/CD35, e subconjuntos foliculares podem ser ainda divididos em subconjuntos de células foliculares maduras tipo I e folicular tipo II B, dependendo do nível de sua expressão de superfície IgM e ^IgD24. Essas populações de células B esplênicas expressam predominantemente cadeia de luz Igκ. Finalmente, as populações de células B-1 B, que se originam no fígado fetal e são encontradas principalmente nas cavidades peritoneal e pleural de camundongos adultos, foram descritas na literatura. Estas células B peritoneal podem ser distinguidas das células B-2 B descritas anteriormente pela falta de expressão CD23. Eles são então subdivididos em populações B-1a ou B-1b, com o primeiro definido pela presença de CD5 e o segundo por sua ^ausência25. Progenitores de células B-1 são abundantes no fígado fetal, mas não são encontrados em BM adulto. Enquanto as células B-1a e B-1b são originárias de diferentes progenitores, ambas semearam as cavidades peritoneal e ^pleural24. Em contraste com as células B-2, as células B-1 são exclusivamente capazes de auto-renovação e são responsáveis pela produção de anticorpos IgM naturais.

Defeitos no desenvolvimento celular B podem surgir em muitos casos, incluindo deficiências nos componentes do ^BCR26,27, perturbações de moléculas de sinalização que impactam a força de sinalização BCR14,28,29, ou interrupção de citocinas que modulam a sobrevivência celular ^B30,31 . A análise da citometria de fluxo dos compartimentos linfoides contribuiu para a caracterização dos blocos de desenvolvimento de células B nesses camundongos e muitos outros. Uma vantagem da análise citométrica de fluxo dos compartimentos linfoides é que ele oferece a capacidade de fazer medições em células individuais obtidas a partir de tecido dissociado vivo. A disponibilidade de reagentes em uma gama cada vez maior de fluoroforos permite a análise simultânea de múltiplos parâmetros e permite a avaliação da heterogeneidade celular B. Além disso, a enumeração das células B por análise citométrica de fluxo complementa outros ensaios imunológicos, como métodos imunohistoquímicos que visualizam a localização celular dentro de órgãos linfoides, detecção de níveis de anticorpos circulantes como medida de imunidade humoral, bem como duas microscopia fótons para medir as respostas das células B no espaço real e no ^tempo32.