Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Monoklonal antikorlar, ana akım tıbbın bir parçası haline geldikçe birçok insan hastalığı için giderek daha fazla tercih tedavisi haline ^{gelmiştir1,2}. Daha önce, fare IgH ^sabitleri3,4 ile tamamen insan değişken bölgelerini barındıran antikorları verimli bir şekilde üreten genetik olarak tasarlanmış fareleri tanımladık. Son zamanlarda, farklı antijen ^{bağlayıcısı} olan antikor benzeri moleküller üreten genetik olarak tasarlanmış fareleri tanımladık5. Antikorlar B hücreleri tarafından salgılanır ve uyarlanabilir humoral bağışıklığın temelini oluşturur. B-1 ve B-2 olmak üzere iki farklı tip B hücresi vardır. Memelilerde B-1 hücreleri fetal karaciğerden kaynaklanır ve doğumdan sonra mukozal dokular ile plevral ve periton boşluklarında zenginleştirilirken, B-2 hücreleri doğumdan önce fetal karaciğerden ve daha sonra kemik iliğinde (BM) kaynaklanır. B-2 hücreleri dalak ve kan dahil sekonder lenfoid organlarda zenginleştirilir6,7,8. BM’de, B-2 hematopoetik progenitörler, Ig mu ağır zincir yeniden düzenlemesinin başlatılması üzerine B yanlısı hücrelere farklılaşmaya ^başlar9,10. Ig ağır zincirinin ve montajının B öncesi hücre reseptörüne (BCR öncesi) başarılı bir şekilde yeniden düzenlenmesi, sinyalizasyon ve proliferatif genişleme ile birlikte B öncesi hücrelere farklılaşmaya yol açar. B öncesi hücreler Ig kappalarını (Igφ) yeniden düzenledikten sonra veya verimsizse, Ig lambda (Igφ) ışık zincirleri, ağır μ zincirle eşleşerek yüzey IgM BCR ekspresyozunu elde ederler. IgM yüzey ekspresyonunun otoreaktivite koşullarında azaldığının bilindiğini, böylece fonksiyonel olarak yanıt vermeyen veya anjik B hücrelerinde kendine toleransa katkıda bulunduğunu belirtmek ^{önemlidir11,12}. Olgunlaşmamış B hücreleri daha sonra IgD’yi birlikte ifade etmeye ve BM’den dalağa göç etmeye başladıkları bir geçiş aşamasına girerler. Dalakta, IgD ekspresyasyonu daha da artar ve hücreler geçiş B hücrelerinin ikinci aşamasına olgunlaşır, ardından olgunlaşma durumlarının ve gelişimlerinin marjinal bölge (MZ) veya foliküler (Fol) hücrelere tamamlanması13,14,15. Yetişkin farelerde, hastalıklı olmayan bir ortamda, BM’de günlük 10-20 milyon olgunlaşmamış B hücresi üretilmesine rağmen olgun B hücrelerinin sayısı sabit kalır. Bunlardan sadece yüzde üçü olgun B hücrelerinin havuzuna girer. Periferik B hücre bölmesinin büyüklüğü, kısmen kendi kendine reaktivite ve eksik olgunlaşma dahil olmak üzere çeşitli faktörler nedeniyle hücre ölümü ile kısıtlanır16,17,18. Akış sitometrik analizi, insanlarda ve farelerde birçok bağışıklık hücresi alt bölmesini karakterize etmek ve numaralandırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. İnsan ve murine B hücre bölmeleri arasında bazı benzerlikler olsa da, bu protokol sadece murine B hücrelerinin analizi için geçerlidir. Bu protokol, genetik manipülasyonun B hücre gelişimini değiştirip değiştirmeyeceğini belirlemek için genetik olarak tasarlanmış fareleri fenotipleme amacıyla geliştirilmiştir. Akış sitometrisi, hücre aktivasyonu, fonksiyon, çoğalma, döngü analizi, DNA içerik analizi, apoptoz ve hücre sıralama ^19,20’yi ölçmek de dahil olmak üzere birçok ek uygulamada çok popüler olmuştur.

Akış sitometrisi, dalak, BM ve kan gibi karmaşık organlar da dahil olmak üzere farelerde ve insanlarda çeşitli lenfosit bölmelerini karakterize etmek için tercih edilen araçtır. Akış sitometrisi için yaygın olarak bulunan fareye özgü antikor reaktifleri nedeniyle, bu teknik sadece hücre yüzey proteinlerini değil, aynı zamanda hücre içi fosfoproteinleri ve sitokinleri ve fonksiyonel okumaları araştırmak için de ^{kullanılabilir21}. Burada, akış sitometri reaktiflerinin ikincil lenfoid organlarda olgunlaştıkça ve farklılaştıkça B hücreleri alt kümelerini tanımlamak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Boyama koşullarının optimizasyonu, numune işleme, doğru cihaz kurulumu ve veri toplama ve son olarak veri analizinden sonra, farelerdeki B hücre bölmesinin kapsamlı akış sitometrik analizi için bir protokol kullanılabilir. Bu tür kapsamlı analizler, Gelişmekte olan BM B-2 hücrelerinin B220, CD43, BP-1, CD24, IgM ve ^IgD22 ifadelerine bağlı olarak farklı fraksiyonlara (Fraksiyon) ayrılabileceği Hardy ve meslektaşları tarafından tasarlanan onlarca yıllık bir isimlendirmeye dayanmaktadır. Hardy ve ark., B220⁺ CD43 BM B hücrelerinin BP-1 ve CD24 (30F1) ekspresyerine dayanarak dört alt kümeye (Fraksiyon A-C’) bölünebileceğini, B220⁺ CD43^{-(sönük ila neg)} BM B hücrelerinin igd ve yüzey ^IgM23’ün farklı ifadesine dayanarak üç alt kümeye (Fraksiyon D-F) çözülebileceğini göstermiştir. Kesir A (B öncesi hücreler) BP-1^– CD24 (30F1)^–, Kesir B (erken B öncesi hücreler) BP-1^– CD24 (30F1)⁺, Fraksiyon C (geç pro-B hücreleri) BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺, Fraksiyon C’ (erken B öncesi hücreler) ise BP-1⁺ ve CD24high olarak tanımlanır. Ayrıca, Kesir D (B öncesi hücreler) B220⁺ CD43^– IgM^– B hücreleri, Kesir E (yeni oluşturulan B hücreleri, olgunlaşmamış ve geçiş kombinasyonu) B220⁺ CD43^– IgM⁺ B hücreleri ve Fraksiyon F (olgun, yaslanan B hücreleri) B220high CD43^– IgM⁺ B hücreleri olarak tanımlanır. Buna karşılık dalakta bulunan naif B hücrelerinin çoğunluğu CD93, CD23 ve IgM ekspresyonuna bağlı olarak olgun (B220⁺ CD93^–) B hücrelerine ve geçiş (T1, T2, T3) hücrelere ayrılabilir. Olgun B hücreleri, IgM ve CD21/CD35 ekspresyonuna göre marjinal bölge ve foliküler alt kümelere çözülebilir ve foliküler alt kümeler, IgM ve IgD yüzey ekspresyonlarının seviyesine bağlı olarak olgun foliküler tip I ve foliküler tip II B hücre alt kümelerine ^{ayrılabilir24}. Bu dalak B hücre popülasyonları ağırlıklı olarak Igφ ışık zincirini ifade eder. Son olarak, fetal karaciğerden kaynaklanan ve esas olarak yetişkin farelerin periton ve plevral boşluklarında bulunan B-1 B hücre popülasyonları literatürde tanımlanmıştır. Bu periton B hücreleri, CD23 ekspresyonu eksikliği ile daha önce tanımlanmış B-2 B hücrelerinden ayırt edilebilir. Daha sonra B-1a veya B-1b popülasyonlarına ayrılırlar, birincisi CD5’in varlığı ve ikincisi ^yokluğu25 ile tanımlanır. B-1 hücreli atalar fetal karaciğerde bol miktarda bulunur, ancak yetişkin BM’de bulunmaz. B-1a ve B-1b hücreleri farklı progenitörlerden kaynaklanırken, her ikisi de periton ve plevral boşlukları ^tohumlar24. B-2 hücrelerinin aksine, B-1 hücreleri benzersiz bir şekilde kendini yenileyebilir ve doğal IgM antikorlarının üretiminden sorumludur.

B hücre gelişimindeki kusurlar, ^BCR26,27 bileşenlerindeki eksiklikler, BCR sinyal gücünü etkileyen sinyal moleküllerinin pertürbasyonları14,28,29 veya B hücre sağkalımını modüle eden sitokinlerin bozulması dahil olmak üzere birçok durumda ortaya ^{çıkabilir30,31} . Lenfoid bölmelerin akış sitometri analizi, bu farelerde ve diğer birçok kişide B hücre gelişim bloklarının karakterizasyonuna katkıda bulunmuştur. Lenfoid bölmelerin akış sitometrik analizinin bir avantajı, canlı ayrışmış dokudan elde edilen tek tek hücreler üzerinde ölçüm yapma yeteneği sunmasıdır. Reaktiflerin sürekli genişleyen bir florofor aralığında bulunması, birden fazla parametrenin eşzamanlı olarak analizini sağlar ve B hücre heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, B hücrelerinin akış sitometrik analizi ile numaralandırılması, lenfoid organlarda hücre lokalizasyonunu görselleştiren immünhistokimya yöntemleri, dolaşımdaki antikor seviyelerinin humoral bağışıklık ölçüsü olarak tespiti ve B hücre yanıtlarını gerçek uzay ve zamanda ölçmek için iki foton mikroskopisi gibi diğer immünolojik tahlilleri ^tamamlar32.